Schlussbetrachtung

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Timm Piper´s
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Seit Jahrhunderten ist das Mikroskop für viele Wissenschaftler ein wichtiges Arbeitsmittel und auch heutzutage hat es bei vielfältigen Anwendungen in Forschung und Routine seinen festen Platz.

Zu Beginn ihrer Entwicklung basierten Mikroskope ausschließlich auf Hellfeld-Beleuchtung, so dass Objekte im durchfallenden Licht mehr oder weniger axial durchleuchtet werden konnten. In dieser Technik sind sehr kleine und dünne Objekte von geringer optischer Dichte, so beispielsweise lebende Zellen, ungefärbte Bakterien und Mikroorganismen nur schwach erkennbar oder unsichtbar. Als nächster „Meilenstein“ wurde die Dunkelfeld-Mikroskopie entwickelt. Im Jahr 1837 veröffentliche Joseph Bancroft Reade erste Konstruktionen eines Beleuchtungsapparates, welcher für Dunkelfeld-Untersuchungen vorgesehen war. Es folgte Francis Herbert Wenham, der verschiedene technische Realisationen einer Dunkelfeld-Beleuchtung in den Jahren 1852 bis 1856 publizierte. Im Jahr 1905 wurde Spirochaeta pallidum, der Erreger der Syphilis (Lues) erstmalig von Fritz Schaudinn und Erich Hoffmann mikroskopisch beobachtet, und zwar mit Hilfe eines Dunkelfeld-Mikroskops. Das Phasenkontrast-Verfahren wurde von Frits Zernike entwickelt und in 1942 publiziert; 11 Jahre später wurde ihm für diese Erfindung der Nobelpreis für Physik zuerkannt. Im Phasenkontrast konnten auch farblose Objekte sehr geringer Dichte erstmals in einer neuen und bisher nicht möglich gewesenen Qualität und Klarheit lebend beobachtet werden. Dies führte in der Folgezeit zur weitergehenden Erforschung verschiedener fundamentaler Phänomene wie beispielsweise der Mitose und Meiose, deren Abläufe nun mittels Phasenkontrast in lebenden Zellen effektiv studiert werden konnten.

Dieser Tradition folgend, stellen Hellfeld, Dunkelfeld und Phasenkontrast auch heutzutage die weitest verbreiteten und meist angewendeten Applikationen in der Lichtmikroskopie dar. Dennoch ist jede dieser Beleuchtungstechniken mit typischen Limitierungen und Artefakten behaftet und jede dieser Techniken führt zu komplementären bzw. ergänzenden visuellen Informationen. So können, wie schon erwähnt, farblose Objekte von geringer Dichte nicht gut in Hellfeld erkannt werden, und lichtabsorbierende Strukturen, welche für Hellfeld prädestiniert sind, sind in Phasenkontrast in der Regel nicht zufriedenstellend untersuchbar. Im Dunkelfeld können feine Details im Inneren von Objekten verloren gehen, wenn sie nicht von den schräg einfallenden Beleuchtungsstrahlen getroffen werden. Im Hellfeld ist die laterale Auflösung durch Beugung limitiert, und im Phasenkontrast können feine Strukturen durch typische Artefakte (Haloing und Shade-off) maskiert werden; im Dunkelfeld kann die Klarheit von Objektdetails durch Beugung und Streuung verringert sein. Schließlich kann im Dunkelfeld und Phasenkontrast die Bildgebung jeweils nicht mittels Aperturblende beeinflusst werden, da diese Blende, falls vorhanden, weit geöffnet bleiben muss.

Angesichts dieser Limitierungen stellte ich mir die Aufgabe, verschiedene verbesserte Beleuchtungstechniken zu entwickeln, welche jeweils auf adäquaten Kombinationen der drei vorbeschriebenen Basismethoden aufbauen. So wurde Hellfeld mit Dunkelfeld und Phasenkontrast kombiniert und Phasenkontrast zusätzlich mit Dunkelfeld. Darüber hinaus wurden in einzelnen Fällen auch diese drei Beleuchtungsverfahren zeitgleich ausgeführt. Auf diese Weise konnten alle potentiell in Betracht kommenden Kombinationen konsequent in Standard-Mikroskope implementiert werden, für Routineuntersuchungen eingesetzt und ausgiebig praktisch getestet werden.

Um möglichst gute optische Resultate zu erreichen, wurden verschiedene Modifikationen im Hinblick auf den Beleuchtungsapparat durchgeführt. Folgerichtig wurden Standard- Kondensoren für meine neuen Methoden modifiziert und mit verschiedenen speziellen hand-gefertigten Lichtmasken als Prototypen ausgestattet. Darüber hinaus wurden Spiegelobjektive verwendet und es wurden spezielle lichtmodulierende Einsatzelemente für herkömmliche Linsenobjektive erstellt, welche den Strahlengang beeinflussen. Alle technischen Varianten wurden so durchgeführt, dass die Aperturblende des Kondensors für Modifizierungen der Bildgebung und Steigerungen der finalen Bildqualität verwendet werden konnte.

Unter wissenschaftlichem Aspekt kann als spezielles Charakteristikum meiner Methode herausgestellt werden, dass die visuelle Gesamtinformation, welche lichtmikroskopisch erschlossen werden kann, speziell bei der Beobachtung sogenannter „Problemobjekte“ gesteigert wird, dies auch im Falle von Objekten, die in den herkömmlichen Methoden nicht zufriedenstellend untersucht werden können. Die präsentierten Abbildungen geben verschiedene eindrucksvolle Beispiele für die erreichbaren qualitativen Verbesserungen. Im Besonderen kann die dreidimensionale Architektur komplex strukturierter Objekte in überlegener Deutlichkeit visualisiert werden, ebenso auch oberflächliche Texturen und feine Details im Inneren transparenter Objekte. Lichtabsorbierende und lichtreflektierende Strukturen hoher Dichte sind gleichzeitig mit phasenverschiebenden Strukturen geringer Dichte in einem Bild sichtbar. In Objekten, bei denen eine hohe Schwankungsbreite der regionalen Schichtdicke und optischen Dichte besteht, können alle Zonen zeitgleich in optimierter Qualität betrachtet werden. Die komplementären Informationen von Hellfeld, Dunkelfeld und Phasenkontrast können in den resultierenden Bildern miteinander kombiniert werden und typische Artefakte wie Haloing, Shade-off, Überstrahlung und Streuung werden reduziert. Auf diese Weise sind die Bilder, welche mit meinen neuen Methoden erhältlich sind, durch eine verringerte Artefakt-Rate charakterisiert, und sie zeigen gleichzeitig eine verbesserte Präzision in der Visualisierung feiner Details, eine gesteigerte Schärfentiefe (Tiefenschärfe) bei gleichzeitig erhaltener exzellenter lateraler Auflösung.

In vielen wissenschaftlichen Anwendungsbereichen, welche sich mit der Lichtmikroskopie befassen und Hellfeld, Dunkelfeld und Phasenkontrast als Standardmethoden einsetzen, versprechen meine neuen Methoden fundamentale Verbesserungen der globalen Bildqualität und visuellen Information. Mein Projekt ist daher für jedermann relevant, der in der Lichtmikroskopie engagiert ist und die Lichtmikroskopie für seine Aufgabenstellungen in Forschung und Routine einsetzt. Darüber hinaus kann auch von meinen Methoden profitieren, wer nicht unmittelbar Lichtmikroskope selbst einsetzt, aber von den wissenschaftlichen oder praktischen Ergebnissen profitiert, welche mit Mikroskopen erarbeitet werden.

Die bis jetzt durchgeführten praktischen Evaluationen basieren auf handgearbeiteten Prototypen verschiedener Lichtmasken und lichtmodulierender Objektiveinsätze. Hierüber hinausgehend, könnten auch spezielle Universal-Kondensoren mit modifizierten Lichtmasken ausgestattet werden, welche auf einer drehbaren Revolverscheibe angeordnet sind. Zusätzlich könnten auch Doppel-Irisblenden-Systeme und verschiedene Polarisationsfilter entsprechend meiner Vorschläge in solche Kondensoren integriert werden, so dass die Intensitäten der jeweils überlagerten Teilbilder und die zugehörigen Beleuchtungsaperturen in maximaler Varianz regulierbar wären. Für Aufgabenstellungen, welche auf axialem VPDK basieren, könnten spezielle Phasenkontrast-Objektive hergestellt werden, welche eine modifizierte Phasenplatte enthalten, auf welcher in der Mitte des Phasenringes ein zusätzlicher zentrischer Lichtstopper platziert ist. Alternativ könnten solche Spezial-Objektive auch mit miniaturisierten Lichtstoppern auf einführbaren Schiebern ausgestattet werden, welche in der hinteren Objektiv-Brennebene einzubringen sind. Für alle Anwendungen, bei denen Dunkelfeld-Beleuchtung beteiligt ist (VHDK und VPDK), könnten die jeweils verwendeten Objektive auch mit einer Irisblende versehen werden, so dass die mit Dunkelfeld assoziierten Streuungs- und Überstrahlungsphänomene noch weitergehend reduziert werden könnten. Schließlich könnten auch Spiegelobjektive mit Phasenringen ausgestattet werden, so dass deren zentrischer Konvexspiegel als Lichtstopper für axiale Dunkelfeld-Beleuchtung verwendbar ist und der Phasenring eine gleichzeitige Phasenkontrast-Beleuchtung ermöglicht. Auf diese Weise könnten die speziellen Vorteile von Spiegelobjektiven, wie lange Arbeitsabstände, große Sehfelder, höchstmögliche Planität, fehlende chromatische Aberration und UV- sowie IR-Tauglichkeit auch für meine neuen Methoden erschlossen werden. Darüber hinaus könnten meine Methoden auch in Auflicht-Illuminatoren implementiert werden, so dass die Materialkontrolle und Materialwissenschaften neue Impulse erhalten könnten.

Zusammenfassend könnten die Hersteller optischer Geräte meine Ideen aufgreifen und neue Generationen von Lichtmikroskopen kreieren, welche mit allen beschriebenen Ausstattungsmerkmalen versehen wären, so dass ich davon ausgehe, dass meine Methoden auch ein großes Potential zur herstellerseitigen Kommerzialisierung aufweisen.

Ich gehe davon aus, dass meine Methoden mit überschaubaren Kosten in Standard-Mikroskope integrierbar sind, so dass die beschriebenen Techniken auch von Personen oder Institutionen verwendet werden können, deren Budget begrenzt ist. Und so hoffe ich, dass meine Methoden auch in Entwicklungsländern ohne Konsumierung hoher finanzieller Ressourcen auf nutzbare Weise eingesetzt werden können.



Letztes Update: 10.08.2012
Copyright: Timm Piper, 2012