Prinzipien des VPDK

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Im variablen Phasen-Dunkelfeld-Kontrast (VPDK) wird das Objekt im durchfallenden Licht gleichzeitig von zwei unterschiedlichen Komponenten beleuchtet, welche ein Phasenkontrast- und ein Dunkelfeld-Teilbild erzeugen. Die Dunkelfeld-Beleuchtung kann auf übliche Weise im konzentrisch-peripheren Strahlengang erfolgen, oder sie kann mit axialem Licht ausgeführt werden, so dass axiales (zentrales) Dunkelfeld resultiert. Beide Teilbilder (das Phasenkontrast- und das jeweilige Dunkelfeld-Bild) werden optisch überlagert und interferieren miteinander. Die Durchlassflächen der beiden beleuchtenden Lichtkomponenten und somit auch die Helligkeiten und Intensitäten der zugehörigen Teilbilder können durch den Anwender variiert werden. Auf diese Weise kann die Bildgewichtung in feinen Übergängen verändert werden, so dass der Charakter des resultierenden Bildes von einem Dunkelfeld-dominierten in ein Phasenkontrast-dominiertes Bild überführt werden kann. VPDK kann mit konzentrischem oder exzentrischem (schrägem) Beleuchtungslicht realisiert werden. Teile der beleuchtenden Lichtstrahlen können aus jeder definierten Richtung von einem fakultativ in den Strahlengang einzubringenden Lichtstopper bedeckt werden, wenn in Schrägbeleuchtung gearbeitet werden soll. Der Kondensor ist für VPDK in definierter Weise umzugestalten. Die Aperturblende kann auch in dieser Beleuchtungsvariante zur Modulation des Bildcharakters verwendet werden.

Mit der entwickelten Technik können Phasenstrukturen geringer Dichte und gleichzeitig vorhandene dichtere lichtreflektierende Komponenten innerhalb eines Objektes zeitgleich visualisiert werden. Das Phasenkontrast-Teilbild basiert auf dem nullten Beugungs-Hauptmaximum und wird durch Phasenverschiebung des durchfallenden Lichtes generiert. In dem Dunkelfeld-Partialbild trägt das nullte Beugungs-Hauptmaximum hingegen nichts zum resultierenden Bild bei, da die zugehörigen beleuchtenden Lichtstrahlen am Objektiv vorbei laufen. Daher beruhen die erzeugten Dunkelfeld-Bilder lediglich auf Nebenmaxima; sie kommen durch reflektierte, gestreute und gebeugte Lichtkomponenten zu Stande (Determann und Lepusch, 1981b). Die speziellen Kontrasteffekte meiner neuen Methode resultieren folgerichtig aus der Überlagerung und Interferenz zweier grundlegend unterschiedlicher Teilbilder. Die Dreidimensionalität und Plastizität räumlicher Objekte kann verbessert zur Darstellung kommen, weil die beiden beleuchtenden Lichtkomponenten, welche mit Phasenkontrast und Dunkelfeld assoziiert sind, in unterschiedlichen Einfallswinkeln zum Objekt verlaufen. Die Helligkeit des Bildhintergrundes und die Helligkeit überstrahlter Strukturen kann mit verschiedenen optischen Hilfsmitteln verringert werden (Irisblende im Kondensor, Polarisationstechniken), so dass übermäßige Bandbreiten im Hinblick auf Helligkeit und Kontrast vermieden werden.


Optische Verfahren zur Erzeugung von konzentrisch-peripherem VPDK:

Wenn variabler Phasen-Dunkelfeld-Kontrast auf der Grundlage einer konzentrisch-peripheren Dunkelfeld-Beleuchtung erzeugt werden soll, sind handelsübliche Phasenkontrastobjektive erforderlich, die in herkömmlicher Weise mit einer Phasenplatte und einem Phasenring ausgestattet sind. Ein Hellfeld-Kondensor oder ein handelsüblicher Universal-Kondensor für Phasenkontrastbeleuchtung muss mit modifizierten Lichtmasken für VPDK ausgestattet werden. Solche Masken können, auf Schiebern montiert, in geeignete Standard-Kondensoren eingeführt werden, oder sie können in die Revolver-Drehscheibe normaler Universal-Kondensoren für Phasenkontrast eingebaut werden. Die modifizierten Lichtmasken bestehen jeweils aus einem Paar von konzentrischen Lichtringen: Ein Lichtring für Phasenkontrastbeleuchtung, der mit dem Phasenring des Objektivs optisch kongruent ist und ein zweiter, deutlich größer dimensionierter Lichtring für Dunkelfeld-Beleuchtung. Der Innendurchmesser des letztgenannten Lichtringes muss etwas größer sein als der Durchmesser der Objektiv-Querschnittsfläche, so dass sich dieser Lichtring außerhalb des Objektivs projiziert. Auf diese Weise wird das Objekt in konzentrischem Strahlengang Phasenkontrast-artig von denjenigen Lichtstrahlen beleuchtet, die aus dem inneren Lichtring stammen und durch den Phasenring des Objektivs verlaufen. Zusätzlich wird das Objekt auf Dunkelfeld-artige Weise von den konzentrischen Lichtstrahlen aus dem äußeren Lichtring zirkulär angeleuchtet, welche in schräger Richtung durch das Objekt verlaufen, ohne die Objektivlinsen zu erreichen. In beiden so erzeugten Teilbildern wird das Objekt jeweils von einem konzentrischen Lichtkonus beleuchtet, wobei die Einfallswinkel der beiden unterschiedlichen beleuchtenden Lichtkomponenten verschieden sind. Der zugehörige Strahlengang wird in Abb. 7 schematisch dargestellt.










Abb. 7: Kondensor-basierter VPDK, schematisch.
  1 = Lichtquelle,
  2 = Lichtmaske mit zwei Lichtringen,
  3 = Kondensorlinse,
  4 = Objekt,
  5 = Beleuchtungslicht für Phasenkontrast,
  6 = Beleuchtungslicht für Dunkelfeld,
  7 = Abbildende Strahlen (zwei Komponenten, Dunkelfeld u. Phasenkontrast),
  8 = Objektivlinse,
  9 = Phasenplatte mit Phasenring,
10 = Zwischenbild / Okular,
11 = Auge

 

 



Die Gesamtfläche des inneren Lichtringes, welcher mit Phasenkontrast korrespondiert, muss wesentlich kleiner ausgelegt werden als die Durchtrittsfläche des externen Dunkelfeld-produzierenden Lichtringes. Ansonsten würde das Dunkelfeldbild von dem Phasenkontrastbild massiv überstrahlt. Um gut ausgewogene Verhältnisse im Hinblick auf die unterschiedlichen Teilbilder zu erreichen, sollten spezielle Lichtmasken hergestellt werden, welche im Hinblick auf die Erzeugung der Phasenkontrast-Beleuchtung nur aus einigen wenigen schmalen Perforationen an Stelle eines durchgehenden Kreisringes bestehen. Auf diese Weise kann die Helligkeit des Phasenkontrastbildes wesentlich verringert werden, wenn ein Vergleich zu herkömmlichen Lichtringen gezogen wird, welche aus einer durchgehenden Ringöffnung bestehen. Ein handgearbeiteter Prototyp einer geeigneten Lichtmaske, welche zu gut ausbalancierten Teilbildern führt, wird in Abb. 8a gezeigt; die korrekte Justierung dieser Lichtmaske, deren drei Perforationen sich deckungsgleich zu dem objektivseitigen Phasenring verhalten müssen, werden in Abb. 8b gezeigt. Während der innere Lichtdurchlass im Phasenkontrast-Einstellokular sichtbar ist, da er sich in den Phasenring projiziert, bleibt der äußere Lichtdurchlass unsichtbar, da er außerhalb der Objektiv-Querschnittsfläche projiziert wird. Die Breite des Dunkelfeld-erzeugenden externen Lichtringes kann mit Hilfe der Aperturblende verringert werden. Wenn diese Blende voll geöffnet ist, wird das endgültige Bild von der Dunkelfeld-Komponente beherrscht, und Phasenkontrast-Beleuchtung wird zunehmend dominieren, wenn die Breite des externen Lichtringes durch Verengung der Aperturblende schrittweise verschmälert wird.





 

Fig. 8: Handgefertigte Prototypen einer Kondensor-Lichtmaske für VPDK, montiert auf einem Blendenschieber (a), korrekte Justierung von Phasenring
und inneren Perforationen, kontrolliert mit  Einstell-Lupe (b)


 



Wenn die Breite des äußeren Lichtringes, welcher mit Dunkelfeld korrespondiert, nur moderat mittels Aperturblende verringert wird, können potentielle Dunkelfeld-typische Überstrahlungen und Lichtstreuungen abgeschwächt werden. Zusätzlich ergibt sich eine dezente Aufhellung des Bilduntergrundes; übermäßige Schwankungen in Helligkeit und Kontrast werden verringert und die vertikale Auflösung (Schärfentiefe) kann angehoben werden. Phasenkontrast-Objektive könnten als Prototypen für fortgeschrittene VPDK -Anwendungen dahingehend umgerüstet werden, dass sie mit einer zusätzlichen Irisblende ausgestattet würden, welche in der hinteren Objektiv-Brennebene nahe dem Phasenring einzubauen wäre; in diesem Fall könnte die Objektiv-Apertur mittels dieser integrierten Irisblende auf die gleiche Weise reguliert und dem Objekt angepasst werden, wie in herkömmlicher Dunkelfeld-Mikroskopie üblich. Auf diesem Weg könnten potentiell verbliebene Überstrahlungen und Streuungen weitergehend verringert und die Tiefenschärfe noch mehr gesteigert werden.

Die Projektion der Kondensor-Lichtringe und der Verlauf der beleuchtenden Lichtkomponenten kann in kleinen Schritten an die Beobachtungsgegebenheiten angepasst werden, wenn der Kondensor in vertikaler Richtung geringfügig verschoben wird -, auf die gleiche Weise, wie dies auch in der normalen Dunkelfeld-Mikroskopie gehandhabt wird. Alternativ könnte die Kopflinsengruppe des Kondensors auch bei dieser Beleuchtungsart als Zoom-Linsensystem ausgelegt werden, so dass die Schnittweite des Kondensors kontinuierlich veränderbar wäre.

Um Schrägbeleuchtung zu erzeugen, kann eine Lichtabdeckung in den Kondensor eingebracht werden, so dass, je nach Auslegung, entweder einer oder beide Lichtringe teilweise bedeckt werden. Alternativ könnten auch die kreisrunden Lichtdurchlässe, welche in Abb. 8 gezeigt werden, durch segmental angeordnete schmale Perforationen ersetzt werden, so dass in diesem Fall das Beleuchtungslicht lediglich aus einer definierten Raumrichtung einfallen würde.


Optische Erzeugung von axialem VPDK:

Abb. 9a
zeigt schematisch den Strahlengang in axialem VPDK, welcher mit einem modifizierten Phasenkontrast-Mikroskop erzeugt werden kann; eine Detailansicht der umgestalteten Phasenplatte, ausgerüstet mit Phasenring und zentrisch angeordnetem Lichtstopper, wird in Abb. 9b gezeigt. Die beleuchtenden Lichtstrahlen sind in beiden Teilansichten eingezeichnet. In axialem VPDK wird das Objekt zunächst von einem schmalen axialen Lichtstrahl durchleuchtet, welcher mit der optischen Achse kongruent ist. Dieser Strahl wird innerhalb des Objektivs von einem schmalen Lichtstopper abgedeckt, der sich im Mittelpunkt der Objektiv-Querschnittsfläche, d . h. im Zentrum des Phasenringes, nahe oder in der hinteren Objektiv-Brennebene befindet. Das Objekt wird zusätzlich von einem konzentrischen Lichtkonus beleuchtet, welcher den Phasenring innerhalb des Objektivs so passiert, wie dies auch im herkömmlichen Phasenkontrast vorgesehen ist. Auf diese Weise werden zwei unterschiedliche Teilbilder überlagert: Ein axiales Dunkelfeldbild und ein herkömmlich generiertes Phasenkontrastbild.

Fig. 9: Strahlengang im axialen VPDK (a) und modifizierte Phasenplatte für axialen VPDK (b) .
1 = Lichtquelle, 2 = modifizierte Lichtmaske, 2.1. = Lichtring für Phasenkontrast, 2.2. = zentrische
Perforation für axiales Dunkelfeld, 3 = Beleuchtungslicht für Phasenkontrast (3.1.) und axiales
Dunkelfeld (3.2), 4 = Kondensorlinse, 5 = Objekt, 6 = Objektivlinse, 7 = modifizierte Phasenplatte,
7.1 = Phasenring, 7.2 = zentrischer Lichtstopper, 8 = bildgebende Strahlen für Phasenkontrast und
Dunkelfeld (8.1 und 8.2), 9 = Okular mit Zwischenbild, 10 = Auge


Die Lichtmaske im Kondensor muss entsprechend angepasst werden und mit einer zusätzlichen kleinflächigen zentralen Perforation versehen werden, die sich in der Mitte des Phasenkontrast-Lichtringes befindet. Diese zentrale Perforation muss mit dem Lichtstopper im Objektiv optisch kongruent sein. Beispiele solcher Lichtmasken, welche auf Schiebern montiert sind, so dass sie in Kondensoren eingeführt werden können, werden in Abb. 10 gezeigt. Die Intensität des Beleuchtungslichtes muss unter normalen Umständen im Dunkelfeld wesentlich höher als im Phasenkontrast sein, um adäquate und ausgewogene Bildhelligkeiten zu erreichen. Daher besteht die Notwendigkeit, die Intensität der Phasenkontrast-Beleuchtung gegenüber der Dunkelfeld-Beleuchtung zu begrenzen. Um dies zu erreichen, kann die Breite des Phasenkontrast-erzeugenden Lichtringes minimiert werden (siehe Abb. 10a), oder der Lichtdurchlass für Phasenkontrast kann an Stelle eines durchgehenden Lichtsegmentes aus einigen schmalen Perforationen bestehen (siehe Abb. 10b). Wenn die Breite des Phasenkontrast-Lichtringes als solche unverändert bleibt (vgl. Abb. 10c), kann diese auch durch Verengung der Aperturblende im Kondensor verringert werden.





Fig. 10: Blendenschieber mit modifizierten Lichtmasken, für axialen VPDK, Lichtring in verminderter Breite (a),
ersetzt durch ringförmig angeordnete Perforationen (b), in normaler Breite (c). Schieber a and b für 10x und 16x, c für 25x und 40x vergrößernde Objektive, Beschriftung von Abb. 1.
 






Auch im axialen VPDK kann die Justierung der Kondensor-Lichtmaske, d. h. die korrekte Kongruenz von Kondensor-Lichtring und Phasenring sowie die mittige Position der zusätzlichen axialen Perforation mit einem Einstell-Okular kontrolliert werden. Einige typische Konstellationen, wie sie im axialen VPDK mit einer Einstell-Lupe beobachtet werden können, werden schematisch in Abb. 11 gezeigt. Der zentrale Lichtstopper wird vom Phasenring umgeben (Abb. 11a ); der Lichtring des Kondensors projiziert sich in den Phasenring, und der zusätzliche schmale zentrale Lichtdurchlass, welcher in der optischen Achse verläuft, wird vollständig von dem zentrischen Lichtstopper im Objektiv überdeckt (Abb. 11b). Die Breite des Kondensor-Lichtringes und somit die Intensität des Phasenkontrast-Bildes kann mittels Aperturblende variiert werden. Wenn der Phasenkontrast-erzeugende Lichtring komplett von der Aperturblende überdeckt wird, ergibt sich eine ausschließliche Beleuchtung in axialem (zentralem) Dunkelfeld. Wenn die Aperturblende geringfügig geöffnet wird, kann die Durchlassfläche des Kondensor-Lichtringes in feinen Abstufungen vergrößert werden, so dass ein Phasenkontrast-Bild hinzugefügt und mit dem Dunkelfeld-Bild überlagert wird. Die Intensität des Phasenkontrast -Bildes kann kontinuierlich reguliert werden, so dass der Charakter des resultierenden VPDK-Bildes von einem Dunkelfeld-dominierten bis zu einem Phasenkontrast-dominierten Gesamtbild variiert werden kann.





Fig. 11: Lichtmodulierende Elemente für axialen VPDK,
kontrolliert mittels Phasenteleskop (Einstell-Lupe),
Hellfeld (a),
korrekte Justierung für axialen VPDK (b),
Beschriftung von Abb. 1




Um variablen Phasen-Dunkelfeld-Kontrast auf der Grundlage von axialem (zentralem) Dunkelfeld zu erreichen, wurde ein Phasenkontrast-Objektiv, welches einen herkömmlichen Phasenring enthält, zusätzlich mit einem scheibenförmigen Lichtstopper in zentrischer Position, d. h. im Mittelpunkt des Phasenringes, ausgestattet. Abb. 12 zeigt einen handgefertigten zylindrischen Einsatz, welcher in seiner Mitte einen Lichtstopper trägt und für ein 10-fach vergrößerndes Phasenkontrast-Objektiv vorgesehen ist. Die zugehörigen Justierungsverhältnisse dieser Anordnung werden in Abb. 13 demonstriert. Im hier gezeigten Beispiel kann die Breite des Phasenkontrast-erzeugenden Lichtringes und somit die Gewichtung der Phasenkontrast- und Dunkelfeld-Teilbilder mittels Aperturblende angepasst werden.









Fig. 12: Handgefertigter Prototyp eines für axialen VPDK umgerüsteten Objektivs Leitz Phaco 10/0,25 (links), zylindrischer Einsatz mit kleinem zentrischem Lichtstopper (rechts)




 









Fig. 13: Justierung des Prototyps von Abb. 12 mit einer passenden Kondensor-Lichtmaske für axialen VPDK,
Hellfeld (a), axialer VPDK (b-d), Aperturblende weit geöffnet , Dominanz von Phasenkontrast (b), moderat geschlossen mit ausgewogener Beleuchtung oder relativer Dominanz von Dunkelfeld (c), maximal geschlossen mit  axialem Dunkelfeld (d)






Zur Erzeugung von Schrägbeleuchtung können Teile des Beleuchtungslichts innerhalb des Strahlenganges vor der Objektpassage mit einer lichtundurchlässigen Platte abgedeckt werden.


Beimischung einer zusätzlichen Hellfeld-Beleuchtung:

In beiden Varianten des variablen Phasen-Dunkelfeld-Kontrastes, der konzentrisch-peripheren und axialen Methode, kann ein Hellfeldbild geringer Intensität bedarfsweise als drittes Teilbild hinzugefügt werden, so dass das Objekt in einem „Triplex-Modus“ beleuchtet wird. Dies kann erreicht werden, wenn der maximale Außendurchmesser des Kondensor-Lichtringes etwas größer oder dessen Innendurchmesser etwas kleiner als derjenige des Phasenringes gehalten wird. Alternativ kann die verwendete Kondensor -Lichtmaske auch geringfügig dezentriert werden, so dass ein schmaler Anteil des beleuchtenden Lichtes, welches das Objekt durchdringt, am Phasenring des Objektivs vorbei läuft. Auf diese Weise wird ein Hellfeld-Teilbild zusätzlich erzeugt und mit dem Dunkelfeld- und verbleibendem Phasenkontrast-Bild überlagert. Je mehr der Kondensor-Lichtring dezentriert wird, desto höher ist die Intensität und Dominanz des Hellfeld-Bildes und desto geringer ist das verbleibende Phasenkontrast-Teilbild am finalen Überlagerungsbild beteiligt.



Letztes Update: 10.08.2012
Copyright: Timm Piper, 2012