Optische Kalkulationen

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Bei sämtlichen entwickelten Verfahren (VHDK, VPDK, VPHK) werden mindestens zwei unterschiedliche Beleuchtungstechniken miteinander kombiniert, die sich hinsichtlich ihrer Lichtausbeute beträchtlich unterscheiden. Zusätzlich unterscheiden sich die Aperturen und optisch wirksamen Querschnittsflächen der beteiligten Objektive je nach deren Vergrößerung und optischem Design. Auf Grund dieser Gegebenheiten sollen am Beispiel einer von mir eingesetzten und auch im praktischen Gebrauch allgemein geläufigen Objektiv-Kondensor-Kombination Kalkulationen durchgeführt werden, wie die jeweiligen Lichtdurchlassflächen bei den betreffenden Verfahren ausgelegt werden können, um eine optimale Lichtausbeute und ausgewogene Gewichtungen der jeweils überlagerten Teilbilder zu erhalten.


Methodisches Vorgehen:

Zum Vergleich der jeweils relevanten Lichtstärken und Lichtausbeuten wurden, basierend auf Herstellerangaben und eigenen Messungen neben den in der Mikroskopie geläufigen Aperturwerten korrespondierende Blendenwerte berechnet, welche in der Fotografie als Standard gelten, um Lichtstärken und Bildhelligkeiten anschaulich zu beschreiben.

Die in der Fotografie verwendeten, in definierten Stufen aufeinanderfolgenden „klassischen“ Blendenwerte haben jeweils eine Halbierung der Lichtdurchlassfläche zur Folge; folgerichtig muss bei gleichbleibender Bildhelligkeit die Belichtungszeit um den Kehrwert des Faktors verlängert werden, um welchen die Öffnungsfläche bei Erhöhung des Blendenwertes abnimmt (Tab. 1). Aufeinanderfolgende Blendenwerte unterscheiden sich numerisch durch den Faktor bzw. 1,414. Die Übergänge von einer Blendenstufe zur nächsten können auch als ganzzahlige Vielfache in EV-Stufen (EV = exposure value) angegeben werden; hierbei entspricht eine Blendenstufe jeweils einem EV.



Tab. 1: Zusammenhänge zwischen Blendenwert (Lichtstärke), Lichtdurchlassfläche (Öffnungsweite),
Belichtung und numerischer Apertur NA, Flächen- und Belichtungsänderungen bezogen auf Öffnungsfläche bei Blende 2

Für die Berechnung der Blendenwerte B und der numerischen Aperturen (NA) wurden die folgenden Formeln verwendet (Henkel, 2003):






Tab. 2: Lichtdurchlassflächen und abgeleitete Größen, berechnet für Kondensor mit NA = 0,9 und f = 13 mm,
ausgestattet mit Blendenschiebern (Lichtmasken auf Filterschiebern)


Weitere Verfahrensschritte zur Ermittlung geeigneter Verhältnisse lichtdurchlassender Flächen für VHDK, VPDK und VPHK

Berechnung der Flächen aller verwendeten Lichtdurchlässe, zusätzlich Berechnung der Durchmesser (= Öffnungsweiten) gleichflächiger Kreise (Tab. 2)

Ermittlung von Lichtstärken (Blendenwerten) und NA-Werten der errechneten flächengleichen Kreisöffnungen (Tab.2).

Ermittlung erforderlicher Belichtungszeiten für verschiedene Beleuchtungsarten bei konstanter Intensität der Lichtquelle und gleichbleibenden Objekten (Tab. 3). Unter Berücksichtigung der jeweiligen Durchlassflächen und Belichtungszeiten, kann ein zur ausgewogenen Gewichtung der Teilbilder vorteilhaftes Flächenverhältnis der zugehörigen Lichtdurchlässe für alle neu entwickelten Methoden schlussgefolgert werden.



Tab. 3: Lichtausbeute und -durchlassflächen, korrespondierende Belichtungsänderungen und Belichtungsbeispiele,
ermittelt für verschiedene Beleuchtungsarten
* Belichtungsdaten gelten auch für axiales Dunkelfeld


Erläuterungen zu den Tabellen 2 und 3:

Ausgemessen wurden die Durchlassflächen der herstellerseitig vorgesehenen Lichtblenden auf einsetzbaren Schiebern für Phasenkontrast (Leitz, Phaco 1) und Dunkelfeld (Leitz, DF), zusätzlich auch die selbst hergestellten Prototypen zur Erzeugung der meinerseits entwickelten Beleuchtungsarten (24 Perforationen für Dunkelfeld, zusammenwirkend mit einer Dreilochblende für Phasenkontrast zur Erzeugung von VPDK; axialer Lichtdurchlass für axiales Dunkelfeld oder Hellfeld, zusammenwirkend mit einem normal dimensionierten Phasenkontrast-Lichtring zur Erzeugung von axialem VPDK oder axialem VPHK; 8 Perforationen für konzentrisch-peripheres Hellfeld, zusammenwirkend mit einem normal dimensionierten Phasenkontrast-Lichtring zur Erzeugung von peripherem VPHK).

Zur Abschätzung der relativen Lichtausbeuten bzw. Bildhelligkeiten der unterschiedlichen Beleuchtungsarten wurden mittels Belichtungsmesser einer mikrofotografischen Kamera zunächst die jeweils erforderlichen Belichtungen im Hellfeld, normalen Dunkelfeld und Standard -Phasenkontrast für geeignete typische Standardobjekte ermittelt. Ergänzend wurden auch die korrespondierenden Belichtungen für axiales Dunkelfeld und konzentrisch-peripheres Dunkelfeld, basierend auf den selbst erstellten Lichtdurchlässen für VPDK im peripheren und axialen Dunkelfeld-Strahlengang ermittelt.


Ergebnisse


Optische Auslegungen

Wesentliche optische Auslegungen des Phasenkontrast-Objektivs Phaco 10/0,25 und des zugehörigen Kondensors für Lichtblendenschieber (NA 0,9) werden in den Abbildungen 60 und 61 dargestellt.



Abb. 60: Optische Auslegung des Phasenkontrast-Objektivs Phaco 10/0,25


Für Objektiv Phaco 10 / 0,25 mit NA = 0,25, f= 17 mm und Arbeitsabstand 7,6 mm gilt (vgl. Abb. 60):

Mit der Formel NA= n* sin. (α) kann der max. Einfallswinkel α für die in das Objektiv eintretenden Strahlen auf 14,5° bestimmt werden.

Bei einer Öffnungsweite von 8,5 mm (Abb. 60, rechte Ansicht) ergibt sich bei f = 17 mm eine Lichtstärke (Blendenwert) von 2,0, entsprechend der Lichtstärke des Kondensors bei angepasster Öffnungsweite.


Für einen Kondensor mit NA= 0,9 und f =13mm gilt (vgl. Abb. 61):

Bei voll geöffneter Aperturblende (Öffnungsweite: 23,5mm) beträgt der oben definierte Winkel α 65° (Abb. 61a).

Bei Anpassung der Aperturblende an den optisch wirksamen Objektivquerschnitt ergibt sich ein Aperturblendendurchmesser von 6,5 mm, entsprechend
NAObj.= NAKond.=0,25 und α =14,5° (Abb. 61b)  



Abb. 61:
Optische Auslegung eines typischen Kondensors mit NA = 0,9,
Verhältnisse bei voll geöffneter Aperturblende bzw. voller Öffnungsweite (a)
und bei Anpassung der Aperturblende bzw. Öffnungsweite an die Querschnittsfläche des Objektivs (b)


Bei dem gezeigten Beispiel ist die Objektivquerschnittsfläche (Durchmesser: 8,5 mm) mit einer Aperturblendenfläche von 6,5 mm Durchmesser optisch kongruent. Daher kann die Aperturblende (Maximaldurchmesser: 23,5 mm) auf einen Durchmesser von 6,5 mm verkleinert werden, ohne dass die optisch wirksame Querschnittsfläche des Objektivs tangiert wird. Folglich sind bei dem verwendeten Objektiv 10/0,25 maximal 6,5 mm des Aperturblendendurchmessers für Hellfeldbeleuchtung nutzbar. Ein beobachtbares Hellfeldbild zeigt daher bei schrittweiser Verengung der Aperturblende zunächst keinerlei sichtbare Veränderung, so lange deren Durchmesser oberhalb 6,5 mm bleibt. Erst bei weiterer Verkleinerung des Aperturblendenquerschnitts werden die allgemein bekannten Veränderungen eines Hellfeldbildes, welche durch Schließen der Aperturblende zustande kommen, bei dem verwendeten Objektiv erkennbar (Steigerung von  Kontrast und Schärfentiefe, vermehrte Beugungserscheinungen, verringerte laterale Auflösung).

Bei dem hier gezeigten Objektiv kann bereits Dunkelfeldbeleuchtung erreicht werden, wenn nahe der Aperturblende ein Lichtring in den Kondensor eingesetzt wird, dessen Innendurchmesser geringfügig oberhalb 6,5 mm liegt. Für VHDK müsste dieser Innendurchmesser geringfügig unter 6,5 mm liegen.

Die Lichtausbeute kann bei einer solch individuellen Lichtring-Anpassung an den Objektivquerschnitt optimiert werden, da der Dunkelfeldring im hier kalkulierten Beispiel bei gleichbleibendem Außendurchmesser deutlich breiter ausgelegt werden kann als ein universell einsetzbarer Lichtring für Dunkelfeld, dessen Innendurchmesser üblicherweise deutlich größer ausfällt (z.B. 21 mm beim verwendeten Mikroskop Leitz HM-Lux 3).


Schlussfolgerungen für die Verhältnisse der beleuchtenden Flächen und Vergleichsziehung zu den handgefertigten Prototypen


VHDK (Variabler Hell-Dunkelfeld-Kontrast)

Die Dunkelfeld-erzeugende Lichtdurchlassfläche ist etwa 5,5x so groß wie die Hellfeld-erzeugende (184:33, vgl. Tab. 2 und 3);  zusätzlich muss für gleiche Bildhelligkeiten beider Teilbilder je nach Objekt das Dunkelfeldbild 16x bis 32x länger belichtet werden, sodass zur Anpassung der Belichtungszeiten (Angleichung der Helligkeiten) die Fläche des vorhandenen Dunkelfeld-erzeugenden Lichtrings (184 mm2) in Relation zur Hellfeld-erzeugenden Durchlassfläche(33mm2) um den Faktor 16 bzw. 32 zu vergrößern wäre.

Das Flächenverhältnis der Hell- und Dunkelfeld-erzeugenden Lichtdurchlässe liegt bei ausgewogenen Helligkeiten der Teilbilder zwischen




Peripherer VPDK (Variabler Phasen-Dunkelfeld-Kontrast)

Der Lichtring für Phasenkontrastbeleuchtung ist hinsichtlich seiner Fläche (4 mm2) 46x kleiner, als derjenige für Dunkelfeldbeleuchtung (184 mm2 ). Für identische Belichtungszeiten und Helligkeiten beider Teilbilder müsste der vorhandene Lichtring für Dunkelfeldbeleuchtung je nach Objekt noch etwa 2x bis 4x größer sein.

Das Flächenverhältnis der Phasenkontrast- und Dunkelfeld-erzeugenden Lichtdurchlässe liegt bei ausgewogenen Helligkeiten der Teilbilder zwischen



Die beim handgefertigten Prototyp des Blendenschiebers ausgestanzte Dreilochblende für Phasenkontrastbeleuchtung hat eine Fläche von 0,6 mm2, die für Dunkelfeld angebrachten Perforationen kommen auf eine Gesamtfläche von 75 mm2 (siehe Tab. 2). Dieses empirisch ermittelte Verhältnis von 1:125 entspricht der errechneten Auslegung.


Axialer VPDK (Variabler Phasen-Dunkelfeld-Kontrast)

Die für peripheres Dunkelfeld mit Leitz-Lichtblende (184 mm2) ermittelten Belichtungszeiten gelten ebenso für axiales Dunkelfeld, erzeugt mit zentralem Lichtdurchlass (0,8 mm2). Entsprechend muss auch das axiale Dunkelfeld für gleiche Bildhelligkeiten 2x bis 4x länger belichtet werden als das Phasenkontrastbild, welches bei Verwendung eines herkömmlichen Lichtringes (4mm2) entsteht.

Das Flächenverhältnis der axiales Dunkelfeld- und Phasenkontrast-erzeugenden Lichtdurchlässe liegt bei ausgewogenen Helligkeiten der Teilbilder zwischen



Bei dem handgemachten Blendenschieber wurde der axialen Lichtdurchlass (0,8mm2) mit einem herkömmlichen Lichtring für
Phasenkontrastbeleuchtung (4 mm2) kombiniert (Flächenverhältnis 1:5). Dies ermöglicht variable Übergänge von Phasenkontrast zu Dunkelfeld, da mit der Aperturblende die Dominanz des Phasenkontrast -Teilbildes stufenlos verringert werden kann. Für einen Filterschieber, der maximale Lichtausbeute gewährleisten soll, können für ausgewogene Beleuchtungen die oben errechneten Verhältnisse als Anhaltspunkte dienen


Peripherer und axialer VPHK (Variabler Phasen-Hellfeld-Kontrast)

Bei gleichzeitiger Hellfeld- Phasenkontrast-Beleuchtung ergeben sich gleiche Belichtungszeiten und Bildhelligkeiten der beteiligten Teilbilder, wenn die beiden Lichtdurchlässe dieselbe Fläche aufweisen, da die Verhältnisse der Durchlassflächen und Belichtungszeiten die Selben sind (Tab. 3).

Das Flächenverhältnis der Hellfeld- und Phasenkontrast-erzeugenden Lichtdurchlässe liegt bei ausgewogenen Helligkeiten der Teilbilder bei 1 : 1.

Bei dem angefertigten Prototyp eines Blendenschiebers für axialen VPHK beträgt das Verhältnis der Lichtdurchlässe für Hellfeld und Phasenkontrast 0,8:4 bzw. 1:5 (Tab. 2 ). Somit   sind auch hier Modulationsreserven hinsichtlich der Intensität des Phasenkontrast-Teilbildes vorhanden. Für die Herstellung eines Prototyps, welcher maximale Bildhelligkeit und ausgewogene Ergebnisse ohne Schließen der Aperturblende gewährleisten soll, ist ein Verhältnis der beleuchtenden Flächen von 1:1 vielversprechend.

In dieser Weise wurde der handgefertigte Blendenschieber für peripheren VPHK gestaltet. Acht kreisförmig angeordneten Perforationen zu je 0,6 mm2 (Gesamtfläche: 4,8 mm2)  bilden die außen liegende Durchlassfläche für konzentrisch-peripheres Hellfeld und werden mit einem herkömmlichen Lichtring für Phasenkontrast (4 mm2) kombiniert. Folglich lassen sich hier schon durch minimales Schließen der Aperturblende ausgewogenen Bildhelligkeiten erzielen und bei weiterer Verengung dieser Blende wird Phasenkontrast zunehmend dominieren.

Zusammenfassend können die durch theoretische optische Betrachtungen hergeleiteten technischen Auslegungen für ausgewogene Bildbelichtungen mit allen angefertigten Prototypen gut erreicht werden.

Nach meinen bisherigen praktischen Erfahrungen wird es letztlich von der Art des untersuchten Objektes und der konkreten Fragestellung abhängen, welche der hier vorgestellten Methoden und technischen Auslegungen im Einzelfall zum besten Ergebnis führen.



Quellennachweis: Henkel, Klaus: Die Mikrofibel, Ausgabe: 14.Juni 2003, freier Internet-Download



Letztes Update: 10.08.2012
Copyright: Timm Piper, 2012