Ergebnisse mit VPDK

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Im Vergleich zu Standardmethoden (Hell- und Dunkelfeld, Phasen- und Interferenzkontrast) ist auch VPDK dadurch charakterisiert, dass die axiale Auflösung wesentlich steigt, so dass die Tiefenschärfe (Schärfentiefe) entsprechend angehoben wird. Speziell Objekte von höherer Schichtdicke und komplexer Morphologie können daher in ihrer dreidimensionalen Architektur besser erkannt werden und auch kleine Binnenstrukturen und oberflächliche Texturen sind oftmals besser detektierbar als in herkömmlichen Methoden. Trotz Erhöhung der Schärfentiefe ist die laterale Auflösung nicht sichtbar verringert. In Objekten geringer Schichtdicke (sogenannte Phasenobjekte) können vorhandene feine Abweichungen der optischen Dichte auch im VHDK Phasenkontrast-artig visualisiert werden, wobei allerdings –Halo-Phänomene abgeschwächt sind und manch feine Details in höherer Anzahl und Deutlichkeit sichtbar sind, da eine Dunkelfeld-Komponente hinzugefügt wird. In Objekten mit höherer Schichtdicke (sogenannte Absorptionsobjekte) werden vorhandene natürliche Farben und feine Details in überlegener Deutlichkeit dargestellt, wenn die Bildgebung mit herkömmlichem Hellfeld, Phasen- und Interferenzkontrast verglichen wird. Die Abbildungen 29 bis 34 veranschaulichen den hohen Grad an Bildqualität, welcher mit konzentrisch-peripherem VPDK erreicht werden kann; entsprechende Beispiele für axialen VPDK werden in den Abbildungen 35 bis 38 gezeigt.

Abb. 29 gibt einen Überblick über die hohe Varianz von Kontrastierung und Hintergrundhelligkeit, welche mit VPDK erreichbar ist (Abb. 29b-d); zum Vergleich werden auch konventionelle Phasenkontrastansichten (Abb. 29a) und Dunkelfeldbilder (Abb. 29e) präsentiert. Dunkelfeld-dominierte VPDK-Bilder, wie in Abb. 29d gezeigt, können in intermediäre bzw. gleichgewichtete Phasen-Dunkelfeld-Ansichten überführt werden (Abb. 29c), wenn die Aperturblende des Kondensors dazu verwendet wird, den externen Dunkelfeld-erzeugenden Lichtring in kleinen Schritten zu verengen. Das so erreichbare ausgewogene Phasen-Dunkelfeld-Bild gemäß Abb. 29c kann weiterhin schrittweise in ein Phasenkontrast-dominiertes VPDK-Bild überführt werden (Abb. 29b) und schließlich in ein reines Phasenkontrast-analoges Bild umgewandelt werden (Abb. 29a ), wenn der äußere Lichtring vollständig von der Aperturblende abgedeckt wird.



Abb. 29: Diatomeen, Coscinodiscus sp. (Durchmesser 0,12 mm), Phasenkontrast (a), VPDK (b-d), Phasenkontrast-dominiert (b), ausgewogen gewichtet, mäßige Hintergrundhelligkeit (c), Dunkelfeld-dominiert (d), Standard-Dunkelfeld (e)


Abb. 30 demonstriert den hohen Grad an visueller Information bei Anwendung von VPDK (Abb. 30d und e) im Vergleich zu Standard-Hellfeld (Abb. 30a), Phasenkontrast (Abb. 30b) und Dunkelfeld-Beleuchtung (Abb. 30c). Die hier gezeigten Fadenalgen bestehen aus lichtabsorbierenden Pigmenten und farblosen, optisch dünnen Zellstrukturen; die Algenfäden selbst werden zusätzlich von optisch dünnem anliegendem Material umsäumt. Im Hellfeld sind ausschließlich die lichtabsorbierenden Komponenten erkennbar. Im Phasenkontrast stellen sich die sessilen farblosen randständigen Auflagerungen als Phasenstrukturen in hoher Klarheit dar, allerdings sind diese von schmalen Halo -Säumen umgeben; die optisch dichteren Innenbereiche in den Algenfäden selbst erscheinen jedoch relativ dunkel, so dass deren Struktur nicht in befriedigender Weise erkannt werden kann. Im Dunkelfeld werden die Algen in ihrer natürlichen Farbe und speziell die lichtreflektierenden Innenstrukturen in hoher Klarheit visualisiert; andererseits gehen einige feine Details aufgrund von Überstrahlungen und Streuungen verloren und manche der angelagerten Strukturen im Randbereich der Algen werden nicht klar erkannt, da sie entweder außerhalb der Schärfenebene liegen oder nicht von den schräg einfallenden beleuchtenden Lichtstrahlen getroffen werden. Bei Anwendung des VPDK werden die typischen Vorteile von Hellfeld, Phasenkontrast und Dunkelfeld miteinander vereint, ohne dass die jeweiligen spezifischen Nachteile länger toleriert werden müssen. Insgesamt erscheint die visuelle Information höher als in den konkurrierenden herkömmlichen Techniken, so dass in VPDK sowohl die Fadenalgen in ihrer Eigenfarbe erkennbar sind als auch feine Auflagerungen.



Abb. 30: Fadenalgen (Durchmesser 0,05 mm), Hellfeld (a), Phasenkontrast (b), Dunkelfeld (c),
VPDK, Phasenkontrast-dominiert (d), ausgewogen gewichtet, moderate Hintergrundhelligkeit (e)


Ein ergänzendes eindrucksvolles Resultat zeigt Abb. 31. Auch in den hier demonstrierten Bildern führt die Überlagerung zweier Phasenkontrast- und Dunkelfeld-artiger Bilder zu einer erhöhten visuellen Gesamtinformation, da Phasenstrukturen geringer optischer Dichte klar im VPDK erkennbar bleiben und gleichzeitig Strukturen höherer Dichte oder vermehrter Schichtdicke, welche im normalen Phasenkontrast oder Hellfeld lediglich schwarz oder dunkel, wenig detailreich und Silhouetten-artig in Erscheinung treten, in ihrer natürlichen Farbgebung kontrastiert werden. Im Hellfeld (Abb. 31a) erscheinen die optisch dichten Kugelalgen Haematococcus pluvialis als dunkle Silhouetten, und die umgebenden optisch dünnen Fadenalgen sind kaum erkennbar. Bei Dunkelfeld-Beleuchtung (Abb. 31b) werden hauptsächlich die optisch dichten Haematococcus-Algen in ihrer natürlichen roten Farbe hervorgehoben. Im Phasenkontrast (Abb. 31c) können hingegen hauptsächlich die optisch dünnen Fadenalgen klar erkannt werden, während die optisch dichten Kugelalgen dunkel bis schwarz und strukturlos erscheinen. Die Überlagerung der Phasenkontrast- und Dunkelfeld-Bilder (Abb. 31d) vereinigt die visuelle Information der jeweiligen Einzelbilder in einem Gesamtbild, so dass beide Algenspezies in dieser Technik in allen Details klar erkannt werden können.



Abb. 31: Rot gefärbte Blutregenalgen ( Haematococcus pluvialis), umgeben von optisch dünnen Blau-
und Grünalgen sowie Detritus, Frischpräparat, HFW: 0,8 mm, Objektiv 10x, Hellfeld (a), Dunkelfeld (b),
Phasenkontrast (c), VPDK (d)


Der in Abb. 32 gezeigte Hautflügel eines Käfers kann in wesentlich verbesserter Klarheit präsentiert werden, wenn VPDK angewendet wird. Die Dreidimensionalität und Plastizität des Flügels wird mit maximaler Deutlichkeit im VPDK visualisiert, weil das Objekt gleichzeitig aus unterschiedlichen Winkeln beleuchtet und die Tiefenschärfe angehoben wird. Darüber hinaus sind Helligkeit und Kontrast wesentlich ausgewogener gewichtet, Überstrahlungen, Streuungen und Halo-Artefakte sichtbar reduziert. Im Vergleich zu Phasenkontrast (Abb. 32a) und Dunkelfeld (Abb. 32b ) ist die visuelle Gesamtinformation im VDPK wesentlich erhöht (Abb. 32c). Speziell die vorhandenen Adern zeigen wesentlich mehr feine Details und auch die umgebenden kleinen Haare werden in überlegener Klarheit, ohne nennenswerte Überstrahlungen, Lichtstreuungen oder Halo-Säume dargestellt.



Abb. 32: Insektenflügel (Buntkäfer, Trichodes sp.), HFW: 1 mm, Objektiv 10x, Phasenkontrast (a), Dunkelfeld (b), VPDK (c)


Abb. 33 zeigt das Dauerpräparat eines Borstenwurms (Polychaeta) aus dem Wattenmeer der Nordsee. Dieser Wurm wird vergleichend bei Phasenkontrast-Beleuchtung (Abb. 33a), im Dunkelfeld (Abb. 33b) und VPDK (Abb. 33c) gezeigt. Im Phasenkontrast werden die Weichteile des Wurms gut kontrastiert, aber die zahlreichen feinen Borsten sind nur schwach sichtbar und erscheinen Silhouetten-artig. Im Gegensatz hierzu werden die Borsten bei Dunkelfeld-Beleuchtung in hohem Kontrast akzentuiert, während die umgebenden Weichteile nicht sichtbar sind. Im VPDK werden sowohl die Borsten als auch die umgebenden Weichteile gleichermaßen klar kontrastiert, so dass die visuellen Informationen des Phasenkontrast- und Dunkelfeld-Bildes miteinander kombiniert werden. Daher können beispielsweise die Ursprünge bzw. Abgänge der feinen Borsten innerhalb des Weichteilgewebes einfacher und präziser erkannt werden.



Abb. 33: Maritimer Borstenwurm (Polychaeta), HFW: 1,0 mm, Objektiv 10x, Phasenkontrast (a), Dunkelfeld (b), VPDK (c)


Abb. 34 gibt ein Beispiel für Lichtfilterung im Farb-Doppelkontrast bei Anwendung von VPDK unter zusätzlicher Beimischung eines Hellfeld-Bildes geringer Intensität; letzteres wird erreicht durch geringfügige Dezentrierung der Kondensor-Lichtringe. Im gezeigten Bild werden Phasenkontrast- und Hellfeld-Beleuchtung rot und Dunkelfeld-Beleuchtung blau gefiltert. Im normalen Phasenkontrast (Abb. 34a) sind einige Zonen des Kristalls dunkel bis schwarz kontrastiert, während andere Anteile hell leuchtend erscheinen. In den dunklen und hellen Zonen sind feine Details jeweils schwer erkennbar. Im Dunkelfeld ( Abb. 34b) werden verschiedene Konturen hell überstrahlt, so dass sie in hohem Kontrast erscheinen, während andere Partien des Objektes nicht vom schrägen Beleuchtungslicht getroffen und daher dunkel bleiben, so dass sie nicht gut erkannt werden können. Im VPDK (Abb. 34c) wurden die konzentrischen Lichtringe innerhalb des Kondensors geringfügig verschoben und in eine minimal dezentrierte Position gebracht, so dass eine zusätzliche Hellfeld-Beleuchtung beigesteuert wird. In dieser Variante wird das blau gefilterte Dunkelfeld-Bild mit einem roten Phasenkontrast-Bild überlagert, welchem ein ebenfalls rot gefiltertes Hellfeld-Bild hinzugefügt wird. Als Resultat dieser Technik kann die insgesamt sehr komplexe Struktur der Kristallisation in bester Deutlichkeit erkannt werden.



Abb. 34: Vitamin C-Kristallisation, HFW: 1.0 mm, Filterung des Phasenkontrasts in rot (a),
des Dunkelfelds in blau (b), VPDK im Farb-Doppelkontrast mit leicht dezentrierter Lichtmaske
und Beimischung einer Hellfeld-Komponente (c)


Auch in axialem VPDK können verschiedene Objekte in hoher Darstellungsqualität visualisiert werden, und zwar auch dann, wenn die korrespondierenden Standardmethoden zu keinen befriedigenden Ergebnissen führen. Dies wird in Abb. 35 exemplarisch veranschaulicht. Die Lamellenstrukturen der hier gezeigten Fischschuppe sind im Hellfeld kaum sichtbar, da ihre optische Dichte sehr gering ist und sich nur minimal vom Berechnungsindex des Einbettungsmediums unterscheidet (Abb. 35a). Im herkömmlichen Dunkelfeld werden lediglich im Präparat vorhandene Verschmutzungen (Niederschläge, bestehend aus Detritus, Staub und anderen Partikeln) in hohem Kontrast dargestellt, während die Strukturen der Schuppe selbst praktisch unsichtbar bleiben (Abb. 35b). Normaler Phasenkontrast führt zu einer geringen Bildqualität, da die Schichtdicke des Präparates insgesamt jenseits eines kritischen Limits liegt und zusätzlich das Deckglas in diesem Dauerpräparat leicht geneigt ist (Abb. 35c). In axialem VPDK erscheint die Schuppe in exzellentem Kontrast und hoher Klarheit, in Phasenkontrast-dominierten Ansichten (Abb. 35d) ebenso wie in ausgewogenen gewichteten (Abb. 35e) und Dunkelfeld-dominierten (Abb. 35f) Ausführungsvarianten. Speziell die vorhandenen schmalen Zähnchen, welche den Lamellen aufgelagert sind, werden durch die axiale Dunkelfeld-Komponente klarer hervorgehoben. Darüber hinaus ist die Tiefenschärfe im Vergleich zu normalem Dunkelfeld, Phasenkontrast oder Hellfeld wesentlich erhöht.



Abb. 35: Fischschuppe (Skalar,Pterophyllum scalare) in Standardtechniken und axialem VPDK,
HFW: 0,16 mm, Objektiv 10x, starke Ausschnittsvergrößerung, Hellfeld (a), Dunkelfeld (b),
Phasenkontrast (c), axialer VPDK, Dominanz von Phasenkontrast (d), ausgewogene Gewichtung
von Phasenkontrast und axialem Dunkelfeld (e), Dominanz von axialem Dunkelfeld (f)


Objekte von höherer optischer Dichte oder Schichtdicke, die nicht gut für herkömmliche Phasenkontrast-Untersuchungen geeignet sind, können ebenfalls in axialem VPDK mit gutem Erfolg untersucht werden. Anhand relativ dicker Kieselalgen-Skelette, welche gleichzeitig feine Oberflächentexturen aufweisen, werden unterschiedliche Gewichtungen von Phasenkontrast und axialem Dunkelfeld in Abb. 36 dargestellt. Es ist offensichtlich, dass die Tiefenschärfe im VPDK wesentlich angehoben wird und zusätzlich vorhandene feine Poren in der Deutlichkeit ihrer Darstellung zunehmend verbessert werden, wenn die Aperturblende des Kondensors in kleinen Schritten verengt wird. Phasenkontrast dominiert, wenn die Aperturblende voll geöffnet ist (Abb. 36a und d). Durch geringgradige Verengung der Aperturblende wird axiale Dunkelfeld-Beleuchtung hinzugefügt, so dass speziell die feinen Öffnungen auf den Oberflächen der Kieselalgen -Skelette in besserer Deutlichkeit akzentuiert werden (Abb. 36b und e). Wenn die Aperturblende noch weiter geschlossen wird, werden speziell die feinen Poren in den Kieselalgen-Skeletten in maximalem Kontrast hervorgehoben (Abb. 36c und f).



Abb. 36: Kieselalgen im axialen VPDK, Durchmesser jeweils 0,1 mm, Objektiv 10x, starke
Ausschnittsvergrößerung, Dominanz von Phasenkontrast (a und d), ausgewogene Gewichtung
von Phasenkontrast und axialem Dunkelfeld (b und e), Dominanz von axialem Dunkelfeld (c und f)


Auch in flachen Phasenstrukturen geringer Dichte kann axialer VPDK zu erhöhter Konturschärfe und verbesserter Präzision in der Darstellung feiner linearer Strukturen führen, wenn ansonsten vorhandene Halo-Artefakte reduziert werden; Beispiele hierfür werden in den Abbildungen 37a und b gezeigt.



Abb. 37: Kieselalgenschalen von geringer Dichte, Legepräparat, HFW: 0.17 mm,
Phasenkontrast (a), axialer VPDK (b)


Wie aus Abb. 38 ersichtlich, kann es auch vorteilhaft sein, Farb-Doppelkontrast in Verbindung mit axialem VPDK so anzuwenden, dass die visuellen Informationen der Dunkelfeld- und Phasenkontrast-Bilder in unterschiedlichen Farben hervorgehoben werden. Im hier gezeigten Beispiel ist das axiale Licht, welches zu axialem Dunkelfeld führt, in Rot gefiltert, und der Phasenkontrast-produzierende Lichtring wurde mit einem Blaufilter ausgelegt. Feine kristalline Strukturen, welche in axialem Dunkelfeld rot aufleuchten, sind klar in dieser Farbe hervorgehoben, so insbesondere filigrane Details auf der Oberfläche des Objektträgers und in dem abgebildeten Hauptkristall selbst (Abb. 38a). Die dreidimensionale Architektur des pyramidenförmigen Hauptkristalls wird hingegen durch das blau gefilterte Phasenkontrast-Bild wesentlich akzentuiert. Durch schrittweises Schließen der Aperturblende kann der Anteil des Phasenkontrast-erzeugenden Lichtes graduell abgeschwächt werden, so dass diejenigen Strukturen, welche in axialem Licht beleuchtet werden, schließlich hell auf dunklem Untergrund aufleuchten und so noch weitergehend hervorgehoben werden (Abb. 38b).



Abb. 38: Alaun-Kristallisation, HFW: 0,4 mm, Objektiv 10x, axialer VPDK, Farb-Doppelkontrast,
Phasenkontrast blau, axiales Dunkelfeld rot, ausgewogenen Gewichtung beider Teilbilder (a),
Dunkelfeld-Dominanz (b)



Letztes Update: 10.08.2012
Copyright: Timm Piper, 2012