Ergebnisse mit VPHK

Copyright: Jugend forscht

Timm Piper´s
Mikroskopie-Seiten
Einleitung
Prinzipien des VHDK
Prinzipien des VPDK
Prinzipien des VPHK
Material und Methode
Ergebnisse mit VHDK
Ergebnisse mit VPDK
Ergebnisse mit VPHK
Weiterentwicklungen
des VHDK
Weiterentwicklungen
des VPDK
Weiterentwicklungen
des VPHK
Optische Kalkulationen
Diskussion
Schlussbetrachtung
Ergänzendes 
Bildmaterial
Video Downloads
Quellennachweis
Eigene Publikationen
Patente
Danksagungen
Über mich
Kontakt

Im Vergleich zu herkömmlichen  Beleuchtungstechniken (Hell- und Dunkelfeld, Phasen- und Interferenzkontrast) ist variabler Hell-Dunkelfeld-Kontrast durch einen signifikanten Zuwachs an axialer Auflösung ausgezeichnet, so dass die Schärfentiefe (Tiefenschärfe) signifikant angehoben wird. Daher kann die dreidimensionale Architektur speziell in dicken und komplex strukturierten Objekten wesentlich besser als in den konkurrierenden Einzelmethoden dargestellt werden. Obwohl die axiale Auslösung erhöht wird, ist die laterale Auflösung nicht sichtbar verringert. Auch kleine Strukturen im Inneren von transparenten Objekten, feine Texturen der Objektoberfläche und das dreidimensionale Relief räumlicher Objekte sind auch in dieser Methode oft in überlegener Deutlichkeit erkennbar. In Objekten geringer optischer Dichte können vorhandene feine Dichteunterschiede im VHDK auf eine Phasen- oder Interferenzkontrast-ähnliche Weise sichtbar werden. Der hohe Grad an visueller Information, welche mit VHDK erreichbar ist, wird in den Abbildungen 21 bis 28 demonstriert.

Abb. 21
veranschaulicht die überlegene visuelle Information, welche in konzentrischem Kondensor-basiertem VHDK erreichbar ist, wenn ein Vergleich zu herkömmlicher Hell- und Dunkelfeld-Beleuchtung (Abb. 21a und d) gezogen wird. Unter Verwendung des Einschlussmittels Entellan wurde von einer einzelnen Schneeflocke ein Abdruckpräparat erstellt, welches ohne Deckglas bei niedriger Vergrößerung untersucht wurde; dieser Kristall besteht aus Randkonturen und zusätzlichen Eindrücken bzw. Einbuchtungen, welche mit der regionalen Dicke und dem dreidimensionalen Profil der Kristallarme korrespondieren. In den Standardtechniken sind lediglich die Umrisse des Kristalls klar erkennbar, während das Profil der Kristallarme lediglich in den neuen Techniken erkannt werden kann. Sogar feinste Unebenheiten auf der Oberfläche des Einbettungsmaterials werden deutlich sichtbar. Durch Höhenverstellung des Kondensors kann der Charakter des Bildes von Hellfeld-Dominanz (Abb. 21b) zu Dunkelfeld-Dominanz (Abb. 21c ) verändert werden.








Fig. 21: Schneeflocken-Abdruck in Entellan, Spannweite: 1,0 mm, Objektiv 4x, Hellfeld (a), konzentrischer VHDK (ohne Blendenschieber), relative Hellfeld-Dominanz (b), relative Dunkelfeld-Dominanz (c), norm. Dunkelfeld (d)







 

Auch sehr feine oberflächliche Texturen und Reliefstrukturen in transparenten Kristallisationen können in überlegener Klarheit visualisiert werden, wenn konzentrischer VHDK ausgeführt wird, dies auch bei niedriger Vergrößerung. Ein Beispiel hierfür wird in Abb. 22 anhand eines Vitamin C-Präparates gezeigt. Nur VHDK (Abb. 22c) stellt vorhandene feine Details dar, welche im Hellfeld-Bild (Abb. 22a) verborgen bleiben. Der Kontrast und die Dreidimensionalität können noch weitergehend angehoben werden, wenn die Hell- und Dunkelfeld-generierenden Lichtkomponenten in unterschiedlichen Farben gefiltert werden (Abb. 22d). Obgleich der Bildcharakter eines solchen Farb-Doppelkontrastbildes an ein Polarisationsbild (Abb. 22b) erinnert, erscheinen einige der vorhandenen feinen Innenstrukturen in ihrer räumlichen Anordnung klarer abgrenzbar, wenn VHDK im Farb-Doppelkontrast angewendet wird.







Abb. 22: Vitamin C, Kristallisation ohne Deckglas , HFW: 1,2 mm, Objektiv 4x, Hellfeld (a), Polarisation mit λ/4-Kompensator (b), variabler VHDK in ungefiltertem Halogenlicht (c) und Farb-Doppelkontrast (d).

 




 


 

Wie die Bilder einer Kieselalge in Abb. 23 demonstrieren, führt VHDK zu einer wesentlichen Verbesserung der Tiefenschärfe ohne die laterale Auflösung zu beeinträchtigen, so dass diese Methode auch im höchsten Vergrößerungsbereich eines Lichtmikroskops vorteilhaft eingesetzt werden kann. Im hier gezeigten Beispiel führen nicht nur herkömmliches Hellfeld (Abb. 23a) , sondern auch normaler Phasenkontrast (Abb. 23b) und Dunkelfeld (Abb. 23d) zu unbefriedigenden Resultaten. Wenn VHDK angewendet wird (Abb. 23c), werden jegliche Überstrahlungen deutlich verringert, die Tiefenschärfe wird um ein Vielfaches angehoben und die vorhandenen feinen lamellären Strukturen dominieren den Vordergrund in maximaler Präzision und Deutlichkeit.










Abb. 23: Diatomee (Cocconeis sp.) unter Deckglas, HFW: 20 µm, Objektiv 100x, Okular 12,5x, starke Ausschnittsvergrößerung, Hellfeld (a), Phasenkontrast (b), VHDK, konzentrische  Beleuchtung ohne Blendenschieber (c), Standard-Dunkelfeld (d)

 






 

Anhand einer Navicula-Kieselalge (Abb. 24) kann demonstriert werden, dass mittels VHDK auch Phasenkontrast-ähnliche Ansichten bei Verwendung normaler Hellfeld-Objektive (ohne Phasenring!) erreichbar sind (vgl. Abb. 24c). Die neue Methode stellt die vorhandenen feinen Lamellen dieser Kieselalge ebenso in bester Qualität dar wie deren Randkonturen; zusätzlich ist die Tiefenschärfe maximiert.







Abb. 24: Diatomee (Navicula sp.) unter Deckglas, Länge: 50 µm, Objektiv 100x, Okular 10x, Hellfeld (a), konventioneller Phasenkontrast (b), VHDK, exzentrische Ausführungsvariante ohne Blendenschieber (c)











 

Auch im Blendenschieber-basierten VHDK können komplexe dreidimensionale Strukturen gut visualisiert werden; zusätzlich sind kontinuierliche Übergänge zwischen Hell- und Dunkelfeld-dominierten Ansichten erreichbar, wenn die einfallenden beleuchtenden Lichtstrahlen zu unterschiedlichem Anteil durch den Lichtstopper abgedeckt werden. Dies soll anhand einer Alaun-Kristallisation demonstriert werden (Abb. 25). Das hier gezeigte Präparat wurde in geringer Vergrößerung betrachtet und VHDK wurde mit einem Doppelblendenschieber gemäß Abb. 3 realisiert (siehe Kapitel „Prinzipien des VHDK“). Wenn moderate Anteile des Beleuchtungslichtes am Lichtstopper vorbeigehen, ergeben sich Phasenkontrast-ähnliche Resultate (Abb. 25b und c); sobald hingegen das Beleuchtungslicht vollständig abgedeckt wird, resultiert ein axiales (zentrales) Dunkelfeldbild (Abb. 25d). Selbst bei einem geringen Grad der Abdeckung (Abb. 25b) werden feine Konturen akzentuiert, die im Hellfeld (Abb. 25a) entweder unsichtbar oder nur schwach sichtbar sind. Auch in dieser technischen Ausführungsvariante wird die dreidimensionale Architektur des Objektes besser akzentuiert, wenn ein Vergleich zu herkömmlichen Hell- und Dunkelfeld-Bildern (Abb. 25a und e) gezogen wird; dies gilt gleichermaßen für unterschiedlich gewichtete VHDK-Bilder (Abb. 25b und c) und axiales Dunkelfeld (Abb. 25d).



Abb. 25: Alaun-Kristallisation, Präparat ohne Deckglas, horizontale Feldweite (HFW): 2,0mm, Objektiv 4x,  Hellfeld (a), VHDK mit Blendenschieber, relative Hellfeld-Dominanz (b), relative Dunkelfeld-Dominanz (c), axiales Dunkelfeld mit Blendenschieber (d), normales Dunkelfeld (e)


Auch bei höherer Vergrößerung wird die Erkennbarkeit der Dreidimensionalität mit der Hilfe von Blendenschieber-basiertem VHDK wesentlich verbessert. Wie in Abb. 26 erkennbar, kann die dreidimensionale Architektur der hier gezeigten pyramidalen Alaun-Kristallisation, aufgenommen mit einem 10-fach vergrößernden Objektiv, nur in VHDK erkannt werden (Abb. 26c und d); dem gegenüber erscheint diese Pyramide lediglich als flaches Polygon, wenn sie in herkömmlichem Hell- oder Dunkelfeld (Abb. 26a und b) untersucht wird.









Abb. 26: Pyramidale Kristallisation, Präparat von Abb. 25, HFW: 0,5 mm, Objektiv 10x, Hellfeld (a), konventionelles Dunkelfeld (b), VHDK (c) und axiales Dunkelfeld (d), jeweils mit Blendenschieber

 






 

VHDK und axiales Dunkelfeld sind auch bestens geeignet, wenn Software-basierte, Tiefenschärfe-optimierte Bildüberlagerungen mit Stacking-Software angefertigt werden sollen; denn die Schärfentiefe ist in diesen Methoden deutlich höher als in anderen traditionellen Techniken. In den Abbildungen 27a (Color und Schwarz-Weiß) wurden Foraminiferen (Kammerlinge) in herkömmlicher Dunkelfeld-Beleuchtung fotografiert, und die Abbildungen 27b (Color und Schwarz-Weiß) zeigen dieselben Objekte in axialem Dunkelfeld unter Verwendung des Blendenschiebers von Abb. 3 gemäß dem Strahlengang von Abb. 4a. Um die Schärfe-optimierten Ansichten der Abbildungen 27b zu realisieren, wurde eine Sequenz von 7 Einzelbildern in unterschiedlichen Schärfeebenen aufgenommen und anschließend mittels Stacking-Software überlagert. Combine Z (Hedley, 2011), Picolay (Cypionka, 2011) und Helicon Focus (Heliconsoft , 2011) erwiesen sich für diese Aufgabenstellung als gut brauchbar. In normaler Dunkelfeld-Beleuchtung können diverse feine Öffnungen in den abgebildeten Gehäusen nicht gut erkannt werden, wenn diese nicht von den in schrägem Winkel einfallenden beleuchtenden Strahlen getroffen werden. Dieselben Öffnungen sind hingegen in axialem Dunkelfeld klar erkennbar, da sie rechtwinkelig angeleuchtet werden. Die Abbildung 27 demonstriert auch die hohe Qualität, welche in Schwarz-Weiß-Techniken erreichbar ist, wenn VHDK angewendet wird.




Abb. 27: Foraminiferen (Bolivina sp. u. a .), HFW: 0,6 mm, monochromatisches Grünlicht, λ = 500 nm, konventionelles Dunkelfeld (a), axiales Dunkelfeld mit Blendenschieber, Software-gestützte Überlagerung von 7 unterschiedlich fokussierten Einzelaufnahmen (b), Farbaufnahmen (links), Schwarz-Weiß-Konvertierungen (rechts)




 

VHDK oder axiales Dunkelfeld und herkömmliches Dunkelfeld können in manchen Fällen zu komplementärer visueller Information beitragen. In dieser Situation können zwei Einzelbilder in den jeweiligen komplementären Techniken aufgenommen und anschließend digital miteinander überlagert werden, so dass das rechnergestützt erstellte finale Überlagerungsbild alle insgesamt erhaltenen visuellen Informationen beider Bilder in sich vereint. Ein Beispiel für solche Sandwich-Techniken wird in Abb. 28 gegeben. Das hier gezeigte Foraminiferen-Skelett wurde zunächst in herkömmlichem Dunkelfeld aufgenommen (Abb. 28a), anschließend wurde ein axiales Dunkelfeldbild angefertigt (Abb. 28b).

Während im herkömmlichen Dunkelfeld vor allem die vorhandenen geschwungenen Stützelemente hell aufleuchten, können mehrere kleine Poren nicht adäquat visualisiert werden. Diese Poren erscheinen hingegen in VHDK insgesamt wesentlich deutlicher bei gleichzeitig sichtbar gesteigerter Schärfentiefe. Andererseits sind die Stützelemente in dieser Technik nicht so hell und deutlich akzentuiert, wie im herkömmlichen Dunkelfeld. Wenn beide Bilder überlagert werden, wird eine Dunkelfeld-gemäße Bildgebung erreicht, in welcher die Poren ebenso wie die vorhandenen Stützelemente in maximaler Deutlichkeit hell aufleuchtend kontrastiert sind.


Abb. 28: Foraminifere (Cibicidoides sp.), HFW: 0,3 mm, Objektiv 10x, konventionelles Dunkelfeld (a),
axiales Dunkelfeld mit Blendenschieber (b), rechnergestützte Überlagerung von Bild a und b (c)





Letztes Update: 10.08.2012
Copyright: Timm Piper, 2012