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Hellfeld, Dunkelfeld und Phasenkontrast sind in der Lichtmikroskopie als Standardtechniken zur Untersuchung transparenter Objekte weit verbreitet und allgemein etabliert. Interferenzkontrast (DIC), Fluoreszenz und Polarisationsmikroskopie stellen Zusatztechniken dar, die für spezielle Aufgabenstellungen geeignet sind. Sämtliche dieser unterschiedlichen Techniken sind durch typische Vor- und Nachteile charakterisiert. Zusätzlich bestehen mehrere optische Limitierungen; diese wirken sich vor allem aus, wenn transparente Objekte untersucht werden sollen, die durch hohen Kontrastumfang, markante Randkonturen, feine Innenstrukturen, erhebliche Schwankungen der lokalen Schichtdicke und eine komplexe dreidimensionale Architektur charakterisiert sind. Dies gilt beispielsweise für Kristallisationen, Abdruckpräparate von löslichen Kristallen, Skeletten von Kieselalgen oder Kammerlingen und sonstigen biologischen Objekten, die gleichzeitig aus dichten lichtabsorbierenden und weniger dichten phasenverschiebenden Komponenten bestehen.

In herkömmlicher Hellfeldbeleuchtung sind lichtabsorbierende Objekte sichtbar, wenn sie die Amplitude des durchdringenden Lichtes verändern. Die laterale Auflösung wird in Hellfeld reduziert und Beugungsartefakte werden sichtbar, wenn die Aperturblende geschlossen wird, um die Schärfentiefe zu erhöhen, den globalen Kontrast zu verbessern oder feine Randkonturen von schwach sichtbaren, farblosen Objekten von geringer Dichte im Kontrast anzuheben. Aus diesem Grund erscheinen die Randkonturen solcher Objekte oft dunkel oder schwarz, wenn die Aperturblende entsprechend geschlossen wird. Dennoch bleiben zusätzlich vorhandene feine Innenstrukturen weiterhin oftmals schwach sichtbar oder unsichtbar, vor allem, wenn ihre optische Dichte und ihr Kontrast insgesamt sehr niedrig liegen.

Im Standard-Dunkelfeld können lichtreflektierende Objekte hoher Dichte ebenso untersucht werden wie sehr kleine Objekte geringer Dichte, wenn diese zu einer Beugung des einfallenden Lichtes führen, so dass Phasengrenzen akzentuiert werden. Sehr kleine Objekte, deren Größe jenseits des optischen Auflösungsvermögens liegt, können im Dunkelfeld detektiert werden, wenn durch Ablenkung des einfallenden Beleuchtungslichts großflächigere Beugungsmuster erzeugt werden, deren Ausdehnung optisch auflösbar ist (Tyndall-Effekt, Punktspreizungsfunktion). Auf der anderen Seite können feine Innenstrukturen in der Darstellung verloren gehen, wenn sie nicht von den schräg einfallenden beleuchtenden Lichtstrahlen getroffen werden. Dunkelfeldbilder sind mit extrem hohen Hell-Dunkel-Kontrasten behaftet, weshalb helle Strukturen oft überbelichtet und dunkle Strukturen unterbelichtet erscheinen, wenn sie fotografiert oder ausgedruckt werden. In Folge von Beugung und Streuung erscheinen Randkonturen im Dunkelfeld oft sehr überstrahlt, so dass die Deutlichkeit feiner Details beeinträchtigt werden kann. Die Apertur eines Dunkelfeldkondensors kann normalerweise nicht verringert werden bzw. die Aperturblende, sofern im jeweiligen Kondensor vorhanden, muss weit geöffnet bleiben. Die Schärfentiefe kann daher in normalem Dunkelfeld nicht mittels Aperturblende gesteigert werden und liegt daher niedriger als in korrespondierenden Hellfeldbildern. Im Unterschied zu anderen Beleuchtungstechniken trägt das nullte Beugungshauptmaximum nichts zur Bildgebung bei, so dass die bildgebenden Lichtkomponenten ausschließlich auf sekundären und höheren Beugungsmaxima beruhen.

Für Untersuchungen von Objekten geringer Dichte, welche lediglich die Lichtphase verschieben (so genannte Phasenobjekte) wird in den meisten Fällen Phasenkontrast als Standardtechnik in der täglichen Routine verwendet (Zernike, 1942). Phasenkontrastbilder sind meistens mit Halo-Artefakten behaftet, die als typischer Nachteil dieser Methode angesehen werden können. Halo-Artefakte entstehen speziell in Objekten von kritisch hoher Schichtdicke oder Dichte, so dass die exakte Darstellung ihrer vorhandenen Strukturen beeinträchtigt sein kann. Ebenso wie im Dunkelfeld, kann die Aperturblende, sofern im Kondensor vorhanden, auch bei Phasenkontrast nicht verengt werden, sondern muss voll geöffnet bleiben, so dass die Tiefenschärfe nicht durch eine Verringerung der Kondensorapertur gesteigert werden kann. Shade-off (Zone-of-Action-Effekt) ist ein weiterer typischer Artefakt, der mit Phasenkontrast einhergeht und zu einer verringerten Homogenität in großflächigen Phasenobjekten führt, speziell wenn diese eine konstante Schichtdicke und optische Dichte aufweisen. In Folge dieses Artefaktes erscheint der periphere Bereich solcher Objekte im üblichen positiven Phasenkontrast von geringerer Helligkeit, während die zentralen Abschnitte des Objektes in ihrer Helligkeit bis zur Helligkeit des umgebenden Mediums angehoben werden. Umgekehrte Effekte können in negativem Phasenkontrast beobachtet werden. Auch in Folge dieses Shade-off-Phänomens können bei normalen Phasenkontrastuntersuchungen feine Details im Objektinneren verloren gehen. Die Vorteile und Nachteile des Phasenkontrastverfahrens wurden von zahlreichen Autoren erörtert (Robertson, 1970, Slaghter & Slaghter, 1992, Glückstad et al., 2001, Murphy, 2001, Murphy et al., 2012).

Interferenzkontrast wurde als attraktive Alternative zu Phasenkontrast und Hellfeldbeleuchtung entwickelt. Bei dieser Technik sollte die ideale Schichtdicke und Dichte des Objektes in einem mittleren Bereich liegen, d. h. etwas höher als in typischen Phasenobjekten und etwas niedriger als in typischen Hellfeldobjekten (Determann und Lepusch, 1981). Sehr dünne Objekte extrem geringer Dichte erscheinen im Interferenzkontrast meistens kontrastschwächer als im Phasenkontrast und relativ dicke Objekte werden im Interferenzkontrast in „optischen Schnitten“ dargestellt (Lichtscheidel, 2011), so dass deren dreidimensionale Architektur nicht gut dokumentiert werden kann. Andererseits ist Interferenzkontrast frei von Überstrahlungen und Halo-Artefakten. Die Tiefenschärfe (Schärfentiefe) liegt allerdings niedriger als in den anderen Untersuchungsverfahren. Reliefeffekte, welche im Interferenzkontrast oft sichtbar sind, können im Falle regionaler Schwankungen des Brechungsindex auch „Pseudo-Relief-Phänomene“ darstellen, welche nicht der realen Objektkontur entsprechen.

Nur in doppelbrechenden farblosen Objekten können feine Details durch polarisiertes Licht hervorgehoben werden, und in entsprechender Weise sind Fluoreszenz-Techniken naturgemäß nur geeignet, um fluoreszierende Objekte in hoher Auflösung darzustellen. Folgerichtig können diese Techniken nicht zur Untersuchung von Proben eingesetzt werden, die nicht optisch aktiv bzw. fluoreszierend sind.

Um einige der vorerwähnten Artefakte und optischen Limitierungen zu überwinden, entwickelte ich verschiedene neue Untersuchungstechniken, die jeweils wesentliche Verbesserungen in der Untersuchung sogenannter „Problemobjekte“ erreichen ließen. In vielen Fällen kann die erhältliche visuelle Information wesentlich gesteigert werden, wenn ein Vergleich zu herkömmlichen Techniken gezogen wird. Dies dient sowohl der direkten visuellen Beobachtung als auch der Bilddokumentation.

Im Einzelnen wurden drei unterschiedliche Techniken entwickelt und eingehend praktisch erprobt:

  • Variabler Hell-Dunkelfeld-Kontrast (VHDK)
  • Variabler Phasen-Dunkelfeld-Kontrast (VPDK)
  • Variabler Phasen-Hellfeld-Kontrast (VPHK).

In sämtlichen Methoden werden zwei komplementäre Beleuchtungstechniken miteinander kombiniert und gleichzeitig ausgeführt, so dass zwei unterschiedliche Teilbilder erzeugt und miteinander überlagert werden. Im VHDK wird ein hellfeldartiges Teilbild mit einem Dunkelfeldbild überlagert. Phasenkontrast wird mit Dunkelfeld für die Erzeugung von VPDK kombiniert, oder mit Hellfeld, um VPHK zu erzeugen. Bei denjenigen Varianten, für welche Dunkelfeld benötigt wird, d. h. VHDK und VPDK, kann das Dunkelfeld-Teilbild entweder mit konzentrisch-peripherem Beleuchtungslicht erzeugt werden, analog zur herkömmlichen Dunkelfeldbeleuchtung, oder es kann auf axialem Beleuchtungslicht basieren, welches von einem Lichtstopper im Objektiv geblockt wird (sogenanntes axiales oder zentrales Dunkelfeld).

Die Intensitäten der jeweils erzeugten Teilbilder und somit deren Gewichtung bei der Bildüberlagerung können vom Anwender in feinen Schritten moduliert werden. Auf diese Weise können die resultierenden finalen Bilder entweder von einem der beteiligten Teilbilder dominiert werden oder sie können ausgewogen sein, so dass beide überlagerten Teilbilder zu gleichen Anteilen bildwirksam sind.

Im variablen Hell- und Phasen-Dunkelfeld-Kontrast können die beleuchtenden Lichtkomponenten, die mit den jeweiligen Teilbildern assoziiert sind, in unterschiedlicher Farbe gefiltert werden, so dass feine Details noch weitergehend hervorgehoben werden. Im variablen Phasen-Hellfeld-Kontrast hingegen müssen die unterschiedlichen Lichtkomponenten in verschiedenen Farben gefiltert werden, um adäquate Ergebnisse zu erreichen.

In speziellen Situationen können auch drei Teilbilder erzeugt werden, welche auf Hellfeld, Dunkelfeld und Phasenkontrast basieren („Triplex-Mode“); auch deren Überlagerung kann zu einer erhöhten visuellen Gesamtinformation beitragen.

Die optischen und technischen Details meiner Methoden, die derzeitigen praktischen Ergebnisse ihrer Erprobung und Vorschläge für weitere technische Entwicklungen werden in den folgenden Kapiteln dargelegt.



Letztes Update: 10.08.2012
Copyright: Timm Piper, 2012