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Hellfeld, Dunkelfeld und Phasenkontrast sind weit verbreitete und allgemein geläufige Routine-Methoden, welche in der Lichtmikroskopie zu komplementären Ergebnissen in der Visualisierung unterschiedlicher Strukturen führen. Daher kann die visuelle Gesamtinformation wesentlich erhöht werden, wenn diese Beleuchtungstechniken miteinander kombiniert werden. Durch Überlagerung verschiedener Teilbilder, welche auf unterschiedlichen optischen Phänomen basieren (Absorption, Beugung, Reflektion, Phasenverschiebung, Haupt- und Nebenmaxima) können neue Qualitäten der visuellen Information erreicht werden, welche die etablierten Standard-Methoden sinnvoll ergänzen.

In den verschiedenen technischen Varianten, welche hier vorgestellt wurden, können die axiale Auflösung und Schärfentiefe (Tiefenschärfe) signifikant erhöht werden; je geringer die Kondensor-Apertur eingestellt wird, desto höher ist die erhältliche Schärfentiefe. Dennoch wird bei den hier vorgestellten Methoden die laterale Auflösung nicht sichtbar verringert, solange die numerische Apertur des Objektivs hinreichend bleibt. Weiterhin ist zu berücksichtigen, dass ein potentieller Verlust an lateraler Auflösung, welcher durch eine Verringerung der Beleuchtungs-Apertur hervorgerufen wird, durch schräge oder konzentrisch-periphere Beleuchtung kompensiert werden kann, da die laterale Auflösung in Schrägbeleuchtung höher als in axialer (azimutaler) Beleuchtung liegt.

Der kleinstmögliche Abstand „d“ zweier separater Punkte, die in der Lichtmikroskopie noch getrennt wahrgenommen werden, definiert die laterale Auflösung. Diese ist abhängig von der numerischen Apertur (NA) des Objektivs und der Wellenlänge des Beleuchtungslichtes; sie kann wie folgt abgeschätzt werden:

d = 0.6 λ / NA (Robertson, 1970).

Diese Formel kann für Untersuchungen im Auflicht verwendet werden. Wenn durchfallendes Licht eingesetzt wird, stellt die Apertur des Kondensors einen zusätzlichen Faktor dar, welcher die Distanz „d“ beeinflusst. In diesem Fall kann „d“ wie folgt kalkuliert werden:

d =  λ / (NAObjektiv + NAKondensor) (Determann and Lepusch, 1981a).

In maximaler Schrägbeleuchtung kann die laterale Auflösung verdoppelt werden, so dass gilt:

d =  0.5 λ / (NAObjektiv + NAKondensor) (Leitz Wetzlar GmbH, 1969a).

Die axiale Auflösung ist abhängig von der jeweiligen Apertur und der Gesamt-Vergrößerung
(Vergrößerung Objektiv x Vergrößerung Okular) (Determann and Lepusch, 1981c).

Der Graph und das Nomogramm in Abbildung 62 und 63 veranschaulichen diese Verhältnisse, kalkuliert für herkömmliche Hellfeld-Beleuchtung. Einige repräsentative Werte für die minimal auflösbare Distanz „d“ und die axiale Auflösung gemäß Abb. 62 und 63, welche aus der jeweiligen Apertur und Vergrößerung resultieren, werden in Tab. 4 dargestellt; die zugehörige graphische Präsentation liefert Abb. 64. Wenn die Apertur reduziert wird, steigt die axiale Auflösung in wesentlich höherem Maße als die laterale Auflösung verringert wird. Daher kann ein Zuwachs an axialer Auflösung für die visuelle Information von größerer Bedeutung sein als die hiermit einhergehende, vergleichsweise geringe Minderung der lateralen Auflösung; dies sollte speziell für komplexe dreidimensionale Objekte gelten, welche eine hohe regionale Schichtdicke aufweisen.



Abb. 62: Numerische Apertur (NA) und laterale Auflösung,                        Abb. 63: Tiefenschärfe (µm), Vergrößerung
kalkuliert für monochromatisches Grünlicht (λ = 550 nm);                         und Apertur, modifiziert nach Determann &
modifiziert nach E. Leitz Wetzlar GmbH, 1969                                             Lepusch, 1981




Abb. 64: Apertur, laterale (Graph 1) und vertikale (Graph 2 u. 3) Auflösung,
 kalkuliert für 550 nm Grünlicht und Vergrößerung 400x (Graph 2) und 100x (Graph 3),
y-Achse: Scharf darstellbare maximale vertikale Raumtiefe (Graph 1), 
kleinste darstellbare laterale Distanz zweier Bildpunkte (Graph 2 u. 3)


Numerische Apertur


0.05


0.10


0.20


0.30


0.40


0.50


0.90

Laterale Auflösung [µm]
für λ = 550 nm


10


4


2


1.2


0.9


0.7


0.4

Axiale Auflösung [µm]
für Vergrößerung 100x


250


100


40


25


16


10


4

Axiale Auflösung [µm]
für Vergrößerung 400x


200


60


25


10


6


5


1.6



Tab. 4: Numerische Apertur, laterale und axiale Auflösung


Abb. 23 (siehe Kapitel „Resultate des VHDK“) liefert ein eindrucksvolles Beispiel für die hohe axiale Auslösung, die mit VHDK realisierbar ist. Im hier bezeichneten Bild liegt die axiale Auflösung bzw. Schärfentiefe bei ca. 8 µm, wenn VHDK mit einem 100 -fach vergrößernden Objektiv und einem 12,5-fach vergrößernden Okular ausgeführt wird (Gesamtvergrößerung: 1250x). Unter normalen Umständen kann eine solche axiale Auflösung mit 25-fach vergrößernden Objektiven erreicht werden, entsprechend einer etwa 250 bis 300-fachen Gesamtvergrößerung, keinesfalls hingegen mit 100-fach vergrößernden Objektiven. Dieses Beispiel unterstreicht den Nutzen des VHDK für Untersuchungen dickerer Objekte, speziell im mittleren bis hohen Vergrößerungsbereich.

Es kann als weiterer wesentlicher Vorteil betrachtet werden, dass der Einfallswinkel in verschiedenen der hier vorgestellten Verfahren kontinuierlich verändert werden kann, so dass axiale bzw. azimutale, äquatoriale und konzentrische Beleuchtungen ebenso ausgeführt werden können wie schräge bzw. exzentrische Beleuchtung. Auch auf diese Weise kann die Beleuchtung optimal an die spezifischen Objekt-Gegebenheiten angepasst werden. Darüber hinaus wird die Dreidimensionalität des Objektes in eindrucksvoller Weise akzentuiert, weil die jeweilige Probe zeitgleich von separaten Lichtkomponenten aus unterschiedlichen Einfallswinkeln beleuchtet wird.

Im Vergleich zum herkömmlichen Dunkelfeld sind Überstrahlungen und Streuungen in VHDK und VPDK wesentlich reduziert, so dass feine Innenstrukturen oftmals in erhöhter Klarheit in Erscheinung treten. Hinzu kommt, dass kleine Details, welche in normalem Dunkelfeld ggf. nicht von den schräg einfallenden Lichtstrahlen getroffen werden, deutlicher darstellbar sind, wenn axiales Dunkelfeld an der Objekt-Beleuchtung beteiligt ist.

Im Gegensatz zu herkömmlichen Phasenkontrast-Untersuchungen sind Halo-Artefakte und Shade-off-Phänomene in VPDK und VPHK deutlich verringert oder fehlend; im Unterschied zu Dunkelfeld und Phasenkontrast kann die Aperturblende bei meinen Methoden zur Verbesserung der Bildqualität auf ähnliche Weise verwendet werden, wie in der Hellfeld-Mikroskopie üblich. Darüber hinaus können die Hintergrundhelligkeit und der Charakter des resultierenden Bildes kontinuierlich angepasst werden, so dass der verbleibende Kontrast zwischen Objekt und Bildhintergrund manuell adjustierbar ist. Auch diese Eigenschaft unterscheidet meine neuen Methoden von den herkömmlichen Techniken.

Wenn Dunkelfeld mit axialem Beleuchtungslicht ausgeführt wird, kommen einige zusätzliche charakteristische Vorteile zum Tragen. In diesem Fall basiert das Dunkelfeld-Teilbild auf einem schmalen axialen Lichtstrahl, welcher wesentlich gebündelter und kohärenter ist als im normalen Dunkelfeld. Zusätzlich wird das Objekt in axialem Dunkelfeld rechtwinklig, d.h. lotrecht beleuchtet, so dass auch sehr feine Strukturen an der Auflösungsgrenze des optischen Systems von den beleuchtenden Axialstrahlen erfasst werden, in Analogie zu selbstleuchtenden Körpern hell aufleuchten und in maximierter Sensitivität detektierbar sind. Auch in Materialien von sehr geringer optischer Dichte, welche mit minimalen regionalen Unterschieden des Brechungsindex einhergehen, können äußerst feine Randkonturen in hohem Kontrast akzentuiert werden. Die vertikale Auflösung ist in axialen Dunkelfeldbildern maximiert, weil die Apertur des Beleuchtungsapparates minimiert ist. Dennoch wird auch hier die laterale Auflösung nicht in sichtbarer oder relevanter Weise beeinträchtigt, zumindest in allen praktischen Erprobungen, welche bis jetzt durchgeführt wurden. Die charakteristischen Überstrahlungs- und Beugungserscheinungen, welche normale Dunkelfeldbilder kennzeichnen, sind im axialen Dunkelfeld verringert, da das Beleuchtungslicht einen lotrechten Weg nimmt.

Wie anhand verschiedener Beispielbilder demonstriert wird, sind die vorgestellten Methoden geeignet, reale dreidimensionale Reliefstrukturen in vielen Objekten darzustellen. Insbesondere auch in relativ dicken Objekten können vorhandene Strukturen, welche in unterschiedlichen Ebenen oder Höhen liegen, in den meisten Fällen scharf und voneinander separiert visualisiert werden. Daher können die vorgestellten Methoden auch sehr gut zur Dokumentation der dreidimensionalen Architektur und Reliefstruktur vieler Objekte eingesetzt werden. Diese Eigenschaften unterscheiden meine Methoden auch vom Interferenzkontrast, der zu Pseudo -Reliefeffekten führen kann und aufgrund seiner vergleichsweise geringen Tiefenschärfe üblicherweise „optische Schnitte“ erzeugt, speziell bei Objekten mit höherer Schichtdicke. In den vorgestellten Methoden können farblose Phasenstrukturen zusammen mit umgebenden Lichtabsorbierenden Materialien in natürlicher Farbgebung dargestellt werden. Darüber hinaus kann auch die Klarheit farbloser Strukturen weitergehend durch Farb-Doppelkontrast angehoben werden, der daher als zusätzliches interessantes Merkmal der neuen Methoden betrachtet werden kann.

Da die Intensität der Hintergrundstrahlen vom Anwender beeinflusst werden kann, dürften sich meine Methoden auch gut mit Fluoreszenz-Techniken kombinieren lassen, sofern fluoreszierende Komponenten zusammen mit umgebenden nicht fluoreszierenden Anteilen in einem Bild beobachtet oder fotografiert werden sollen.

Unter ökonomischen und praktischen Aspekten ist vorteilhaft, dass die Mehrzahl meiner neuen Techniken mit Standardobjektiven ausgeführt werden kann, welche für herkömmliche Untersuchungen im Hellfeld oder Phasenkontrast zur Verfügung stehen. Daher entfallen, abgesehen vom axialen VPDK, spezifische Modifikationen der optischen Auslegung dieser Objektive. Unter Berücksichtigung des Umstandes, dass auch Objektive mit geringer oder mittlerer Vergrößerung gut eingesetzt werden können, sollten meine Methoden auch in Stereo-Mikroskope implementiert werden können, sofern diese für Untersuchungen im durchfallenden Licht ausgelegt sind.

Angesehen von den hier vorgestellten Anwendungen im durchfallenden Licht erscheinen die neuen Techniken auch geeignet, einen qualitätsverbessernden Beitrag in der Materialkontrolle zu leisten, wenn sie in Auflicht-Illuminatoren integriert werden.

Neben diesen generellen Aspekten können einige spezielle Betrachtungen zum Kondensor-basierten konzentrischen und exzentrischen VHDK beigesteuert werden. In diesen Techniken bleibt die gesamte vorhandene optische Querschnittsfläche des Objektivs für die Bildgebung nutzbar, da keine Phasenringe oder sonstigen lichtmodulierenden Elemente erforderlich sind. Daher wird die optische Leistungsfähigkeit des verwendeten Objektivs nicht durch zusätzliche „Fremdkörper“ beeinträchtigt. Speziell in dieser Hinsicht unterscheidet sich VHDK auch vom Hoffmann’schen Modulationskontrast (HMC) (Hoffmann, 1977, Hoffmann und Gross, 1975a, b und 1976, Modulation Optics, 2011, Abramowitz und Davidson, 2011) und vom integrierten Modulationskontrast (IMC) (Kleine und Schué, 2009), der als Variante des HMC von FA. Leica in 2009 entwickelt wurde. Bei diesen Techniken geht nämlich mindestens etwa 10% der optisch relevanten Objektiv-Querschnittsfläche für die Bildgebung verloren, da sie von erforderlichen Licht-Modulatoren bedeckt wird. Die Homogenität des Hintergrundes ist ein weiterer diskussionswürdiger Aspekt. Im HMC und IMC führt der erforderliche Lichtmodulator zu einem Helligkeitsgradienten des Bilduntergrundes, welcher sich von dunkel nach hell erstreckt, während der Hintergrund im VHDK eine weitgehend gleichbleibende Homogenität aufweist. Darüber hinaus basieren die meisten Mikroskope für HMC, welche von Herstellern produziert werden, ebenso wie auch der IMC-Modus von Leica ausschließlich auf Schrägbeleuchtung. Diese ist allerdings nicht die bevorzugte Technik zur Untersuchung aller Objekte. In den von mir vorgestellten Techniken kann der Nutzer hingegen selbst entscheiden, ob er Schrägbeleuchtung einsetzen möchte oder nicht.

Auch im Hinblick auf VPHK ergeben sich einige ergänzende spezielle Überlegungen.   Um befriedigende Resultate in VPHK zu erhalten, ist eine zweifarbige Lichtfilterung zwingend erforderlich, da eine einfache Überlagerung von Phasenkontrast- und Hellfeldbeleuchtung zu Beeinträchtigungen der Bildqualität führt. Eine moderate Fehljustierung von Lichtring und Phasenring kann als einfachste Methode betrachtet werden, um bei Verwendung eines Standard-Phasenkontrastmikroskops Hellfeld und Phasenkontrast zu kombinieren. In diesem Fall läuft nämlich ein kleiner Anteil des Beleuchtungslichts am Phasenring vorbei und steuert ein Hellfeldbild bei. Dennoch führen solche artifiziellen Hellfeld-Bilder zu einer deutlichen Verringerung der verbleibenden Bildqualität, da das Phasenkontrast-Bild vom hinzugefügten Hellfeldlicht massiv „gestört“ wird. Aus diesem Grund konnte sich auch die gleichzeitige Anwendung von Hellfeld und Phasenkontrast, welche im historischen Phasenkontrast-Kondensor nach Heine (E. Leitz-Wetzlar) implementiert ist, letztlich nicht durchsetzen. In diesem Kondensor kann ein sehr schmaler Lichtring horizontal verschoben werden, so dass er sich in unterschiedlicher Größe in die hintere Objektiv-Brennebene produziert. Folgerichtig kann im Heine-Verfahren dem Phasenkontrast -Bild ein konzentrisch beleuchtetes Hellfeld-Bild beigemischt werden, wenn ein schmaler Anteil des Kondensor-Lichtringes innerhalb oder außerhalb des Phasenringes zu liegen kommt. In beiden Fällen sind allerdings die Phasenkontrast- und Hellfeld-produzierenden Lichtkomponenten nicht voneinander getrennt; sie verlaufen vielmehr im selben Einfallswinkel zum Objekt. Weiterhin kann im Heine-Kondensor die Breite des Lichtringes nicht vom Anwender beeinflusst werden und das Beleuchtungslicht, welches mit Hellfeld und Phasenkontrast korrespondiert, kann nicht in unterschiedlichen Farben gefiltert werden. Schließlich ist dieser Kondensor nicht mit einer Irisblende ausgestattet. Aufgrund dieser technischen Limitationen wird das Heine-Verfahren in den meisten Objekten nicht zu überlegenen Resultaten führen, wenn Hellfeld und Phasenkontrast miteinander kombiniert werden. Weitere Informationen über diesen Kondensor können dem Internet entnommen werden (James, 2003).

VPHK wird hingegen von verschiedenen technischen Merkmalen charakterisiert, die als „Schlüssel zum Erfolg“ betrachtet werden können: Die beleuchtenden Lichtkomponenten, welche mit Hellfeld und Phasenkontrast assoziiert sind, werden in unterschiedlichen Farben gefiltert; daher bleiben sämtliche visuellen Detailinformationen, welche in beiden Techniken immanent sind, auch im entstehenden Überlagerungsbild erkennbar und unterscheidbar. Beide Anteile des Beleuchtungslichts werden voneinander örtlich separiert und verlaufen in unterschiedlichen Winkeln zum Objekt; hierdurch kann die Plastizität und Dreidimensionalität räumlicher Objekte wesentlich akzentuiert werden. Die Dominanz der überlagerten Teilbilder kann weiterhin vom Anwender stufenlos variiert werden, so dass die Gewichtung von Hellfeld und Phasenkontrast in hoher Varianz an das Objekt angepasst werden kann. Schließlich können verschiedene Parameter, welche für Qualität und Charakter des finalen Bildes von Bedeutung sind (Kontrast, Schärfentiefe, Konturschärfe u. a.), mittels Aperturblende vom Anwender beeinflusst werden. Als weiterer Vorteil kann gelten, dass bei der hinzugefügten Hellfeld-Beleuchtung auf einfache Weise zwischen konzentrisch-peripherem und axialem Licht durch Austausch der jeweiligen Lichtmaske gewechselt werden kann.

Zusammenfassend können meine Methoden insgesamt als attraktive und interessante komplementäre Techniken betrachtet werden, die in verschiedenen Feldern der Lichtmikroskopie exzellente Resultate erwarten lassen, speziell bei der Untersuchung von transparenten, farblosen Objekten, welche eine hohe Bandbreite der optischen Dichte oder regionalen Schichtdicke aufweisen und von einer komplexen dreidimensionalen Morphologie gekennzeichnet sind.



Letztes Update: 10.08.2012
Copyright: Timm Piper, 2012